常晨陽(yáng) 單 嬌 宮小明 潘迎芬

1（聊城海關(guān)，山東聊城 252000）

2（黃島海關(guān)，山東青島 266000）

3（濰坊海關(guān)，山東濰坊 261000）

4（東山海關(guān)，福建漳州 363401）

三聚氰胺，分子式為C3N6H6，是工業(yè)生產(chǎn)中一種重要的氮雜環(huán)有機(jī)物，在生物體內(nèi)會(huì)水解出三聚氰酸，具有生物毒性，人體長(zhǎng)期攝入會(huì)造成腎結(jié)石等疾病，被嚴(yán)禁用于食品加工生產(chǎn)過(guò)程中。但因?yàn)槠浞肿雍扛哌_(dá)66.7%，非法添加到食品中可以虛假提高蛋白質(zhì)含量，2008 年“三鹿奶粉事件”食品安全事件爆出后，國(guó)家對(duì)乳制品中三聚氰胺的抽檢一直是食品安全監(jiān)控的重點(diǎn)項(xiàng)目。

近年來(lái)，隨著乳制品消費(fèi)升級(jí)，零售奶酪市場(chǎng)發(fā)展迅速，其中兒童奶酪產(chǎn)品占據(jù)了一半以上份額，且呈現(xiàn)不斷增長(zhǎng)的趨勢(shì)。兒童奶酪，多屬于天然奶酪再加工的產(chǎn)品，呈半固體狀，含有較多的蛋白質(zhì)、脂肪、糖類(lèi)，基質(zhì)相對(duì)于一般乳液、奶粉更黏稠，提取難度大，比天然奶酪軟很多，具有自身獨(dú)有的特點(diǎn)。

目前已報(bào)道的檢測(cè)三聚氰胺的方法有HPLC法、GC-MS 法、ELISA、毛細(xì)管電泳法等，對(duì)三聚氰胺的檢測(cè)研究對(duì)象多為乳粉和液態(tài)奶，奶酪尤其兒童奶酪興起較晚，鮮有對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)的技術(shù)研究報(bào)道。

本文根據(jù)兒童奶酪的基質(zhì)特點(diǎn)，基于QuEChERS 檢測(cè)原理，結(jié)合具有高檢測(cè)靈敏度的高液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，建立了一種可準(zhǔn)確測(cè)定兒童奶酪中三聚氰胺的快速檢測(cè)方法，該方法簡(jiǎn)單，定性、定量準(zhǔn)確。相較于國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法GB/T 22388—2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測(cè)方法》，無(wú)需固相萃取操作和衍生化處理，更為快速、經(jīng)濟(jì)，為兒童奶酪制品中有毒有害物質(zhì)的快速檢測(cè)提供了參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LCMS-8040 高效液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀，日本島津公司；B-400 粉碎均質(zhì)機(jī)，瑞士步琦公司；ME303 電子天平，瑞士梅特公司；L22-500B超聲波清洗機(jī)，上海皓莊儀器公司；CF16RXⅡ高速離心機(jī)，日本日立公司；MS3 Digital 漩渦混合器，德國(guó)IKA 公司。

三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，純度為99.01%，德國(guó)Dr.公司；Cleanert C18（size:50 μm，60 A）PestiCarb（200 目～400 目），PSA（40 μm～60 μm），博納艾杰爾科技公司；中性Al2O3（柱層析用，100 目～200目），天津科密歐公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理

取市售兒童奶酪棒產(chǎn)品，粉碎機(jī)中打碎，用四分法取100 g 做為分析樣品。

稱(chēng)取試樣1.0 g（±0.01 g）于50 mL 離心管中，放入陶瓷均質(zhì)子，加入10 mL2%的三氯乙酸，渦旋混勻2min，超聲5min 后，加入3gNaCl固體，25mL乙腈，繼續(xù)渦旋混勻2 min，10 000 r/min 高速離心5 min，吸取10 mL 上層乙腈層加入0.5 g PSA，0.5 g C18，1.0 g 中性Al2O3，渦旋混勻，10 000 r/min 高速離心5 min 后，過(guò)孔徑0.2 μm 濾膜后待測(cè)。

1.2.2 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

1.2.2.1 液相色譜條件

色譜柱：沃特世Bridge HILIC 柱（3.5 μm×2.1 mm 100 mm）；流動(dòng)相：溶劑A 為10 mmol/L 醋酸銨，溶劑B 為含10 mmol/L 醋酸銨的乙腈水（V∶V=95∶5）混合溶液；流速:0.4 mL/min；柱溫:30 ℃，進(jìn)樣體積:2 μL。

梯度洗脫：0min～1min，0%A，100%B；1min～2.5 min，0%A～20%A，100%B～80%B；2.5 min～3 min，20%A，80%B；3 min～3.1 min，20%A～0%A，80%B～100%B；3.1 min～7 min，0%A，100%B。

1.2.2.2 質(zhì)譜條件

離子化模式:電噴霧電離ESI（+）；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM模式；碰撞氣：Ar；干燥氣（N2）流速：10 L/min；霧化器（N2）壓力：50 psi；接口溫度：350 ℃；DL 溫度250 ℃；毛細(xì)管電壓：3 500 V；加熱模塊溫度：400 ℃。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

將三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)物質(zhì)配制成高濃度標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用50%甲醇水作為配制儲(chǔ)備液的溶劑。工作使用液現(xiàn)用現(xiàn)配，使用液相條件的初始流動(dòng)相進(jìn)行稀釋定容。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的優(yōu)化

兒童奶酪多呈凝膠狀，蛋白、脂肪含量高，在純有機(jī)溶液乙腈中不溶解，可以將基質(zhì)在2%三氯乙酸酸性水溶液中預(yù)處理，利用陶瓷均質(zhì)子與超聲的協(xié)同提取作用，目標(biāo)物被充分提取后，加入乙腈進(jìn)行溶劑轉(zhuǎn)換。利用鹽包，使乙腈層和水相有效分離，之后用凈化包（C18、PSA、中性Al2O3）吸附脂肪、蛋白等雜質(zhì)進(jìn)行純化。

2.2 色譜條件優(yōu)化

三聚氰胺是強(qiáng)極性物質(zhì)，在C18色譜柱上不易被保留，利用三聚氰胺的親水性質(zhì)，參考FDA 推薦的檢測(cè)三聚氰胺的方法，選擇親水作用色譜柱（HILIC），可以在高乙腈濃度下被保留，通過(guò)提高水相的比例，將三聚氰胺從色譜柱洗脫下來(lái)，進(jìn)入檢測(cè)器，達(dá)到分離檢測(cè)定性定量目的。本試驗(yàn)中的流動(dòng)相，選取對(duì)比了試驗(yàn)中最常用到的流動(dòng)性體系：0.1%甲酸水溶液、0.2%甲酸水溶液、10 mol/L醋酸銨、5 mol/L 醋酸銨（含0.1%甲酸水）、甲醇、乙腈體系進(jìn)行組合試驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)正離子模式下常用的甲酸水對(duì)信號(hào)沒(méi)有明顯提高，而10 mol/L 醋酸銨溶液對(duì)出峰影響較為顯著，乙腈作為流動(dòng)性有機(jī)相優(yōu)于甲醇，最后維持流動(dòng)性體系10 mol/L 醋酸銨溶液濃度下，選擇乙腈水的流動(dòng)性配比，確定步驟1.2.2.1 中流動(dòng)性的比例和及梯度洗脫程序，三聚氰胺在4.1 min 出峰，2 個(gè)監(jiān)控離子對(duì)的峰型良好，離子強(qiáng)度高，對(duì)應(yīng)更低的檢測(cè)限。三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子流色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子流色譜圖

2.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化

使用質(zhì)量濃度500 μg/mL 的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別在質(zhì)譜正負(fù)離子模式下對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行全掃描（Scan），結(jié)果顯示，在正離子模式下的靈敏度高于負(fù)離子掃描模式，確定使用ESI 源的正離子模式進(jìn)行掃描。三聚氰胺分子量為126，掃描到加氫峰質(zhì)譜信號(hào)m/z 127 強(qiáng)信號(hào)，為母離子，通過(guò)產(chǎn)物離子模式（Product Scan）掃描，找到峰度較強(qiáng)、干擾較小的2 個(gè)子離子峰，優(yōu)化掃描離子和電壓，對(duì)離子進(jìn)行微調(diào)，得到m/z 84.8 為定量子離子，m/z 67.7作為定性子離子，確定最佳駐留時(shí)間、碰撞電壓和母子離子電壓等質(zhì)譜參數(shù)，確定檢測(cè)三聚氰胺的MRM條件。三聚氰胺質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 三聚氰胺質(zhì)譜參數(shù)

2.4 方法的線性范圍及定量限

在三聚氰胺質(zhì)量濃度20 ng/mL～200 ng/mL 范圍內(nèi)，以峰面積Y 為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度X 為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得到三聚氰胺的線性方程為Y=174.369X-791，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 1，標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2。在空白基質(zhì)中添加三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，按信噪比（S/N）大于10 計(jì)算，確定本方法的定量限為20 μg/kg，方法靈敏度滿足目前國(guó)家對(duì)奶酪食品中三聚氰胺的限量值為2.5 mg/kg 的監(jiān)控要求。

圖2 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

對(duì)市售常見(jiàn)不同品牌兒童奶酪產(chǎn)品（奶酪棒、奶酪杯）應(yīng)用本方法進(jìn)行三聚氰胺的檢測(cè)，未發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性樣品。對(duì)樣品進(jìn)行100 μg/kg 濃度水平加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 三聚氰胺加標(biāo)的回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

由表2 可知，加標(biāo)回收率在80.6%～91.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 均小于10%，滿足定性和定量檢測(cè)要求。

3 結(jié)論

兒童奶酪具有不同于其他乳制品的特有基質(zhì)特點(diǎn)，在前處理中利用QuEChERS 檢測(cè)原理，對(duì)前處理過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化后，經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單提取凈化處理，便可在高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀上進(jìn)行測(cè)定。試驗(yàn)結(jié)果表明，在20 ng/mL～200 ng/mL 范圍內(nèi)三聚氰胺質(zhì)量濃度與峰面積有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999 1 方法定量限為20 μg/kg，添加水平為100 μg/kg 的加標(biāo)回收率為80.6%～91.2%測(cè)定結(jié)果RSD＜10%。該方法操作簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確性好、靈敏度高，且無(wú)需傳統(tǒng)固相萃取操作，節(jié)約時(shí)間、經(jīng)濟(jì)成本，同樣適用于大批量樣品篩選檢測(cè)。

我國(guó)奶酪市場(chǎng)處于初創(chuàng)時(shí)代，尚未為兒童奶酪建立完整的標(biāo)準(zhǔn)制度。隨著乳制品的消費(fèi)升級(jí)，奶酪及其制品有著廣闊的市場(chǎng)空間，兒童牛乳市場(chǎng)成熟穩(wěn)定后，下一階段將走向兒童奶酪的研究。隨著監(jiān)控政策的不斷完善，兒童食品行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)也將會(huì)進(jìn)一步細(xì)化，檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的制定對(duì)研究者提出更多的技術(shù)需求，監(jiān)管檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)群策群力為中國(guó)兒童產(chǎn)品質(zhì)量安全保駕護(hù)航。