胡文濱

(石藥集團(tuán)高科醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司,河北石家莊 052160)

無菌產(chǎn)品細(xì)菌內(nèi)毒素的控制

胡文濱

(石藥集團(tuán)高科醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司,河北石家莊 052160)

論述了細(xì)菌內(nèi)毒素的有關(guān)問題,以及與熱原,細(xì)菌的關(guān)系,并結(jié)合無菌原料藥生產(chǎn)企業(yè)中無菌室的實際情況,分析了產(chǎn)生細(xì)菌內(nèi)毒素的關(guān)鍵點,提出了如何去除細(xì)菌內(nèi)毒素,為無菌車間注射級產(chǎn)品細(xì)菌內(nèi)毒素的管理提供了思路方法。

細(xì)菌內(nèi)毒素;熱原;細(xì)菌;

1 細(xì)菌內(nèi)毒素

細(xì)菌內(nèi)毒素,英文稱作 Endotoxin,是革蘭氏陰性菌(G-菌)細(xì)胞壁個層上的特有結(jié)構(gòu),內(nèi)毒素的主要化學(xué)成分為脂多糖中的類脂A,內(nèi)毒素只有當(dāng)細(xì)菌死亡溶解或用人工方法破壞菌細(xì)胞后才釋放出來,所以叫做內(nèi)毒素。

脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)由多糖 O抗原、核心多糖和類脂A(lipid A)組成,位于最外層。多糖O抗原向外,由若干個低聚糖的重復(fù)單位組成的多糖鏈,即革蘭氏陰性菌的菌體抗原(O抗原),有特異性。核心多糖由庚糖、半乳糖、2-酮基-3-脫 氧 辛 酸 (2-keto-3-deoxyoctonic acid, KDO)等組成,所有革蘭氏陰性細(xì)菌都有此結(jié)構(gòu)。類脂A是以脂化的葡萄胺二糖為單位,通過焦磷酸酯鍵組成的一種獨特的糖脂化合物,具有致熱作用,是革蘭氏陰性細(xì)菌內(nèi)毒素的毒性成分。

內(nèi)毒素的致病機理:主要是由于革蘭氏陰性菌和其它微生物(病毒、立克次氏體、衣原體螺旋體等)感染時,這類菌屬隨病灶滲液進(jìn)入血液循環(huán),并擴散到各種組織器官和體液細(xì)胞內(nèi)繁殖,這類菌屬在體內(nèi)死亡和解體后,才稀放出大量的細(xì)菌內(nèi)毒素脂多糖(LPS),這些因子刺激體溫調(diào)節(jié)中樞導(dǎo)致機體發(fā)熱。

1.1 細(xì)菌,革蘭氏陽性菌(G+菌)和革蘭氏陰性菌(G-菌)

細(xì)菌英文叫Bacteria,人們通常所說的即為狹義的細(xì)菌,狹義的細(xì)菌為原核微生物的一類,是一類形狀細(xì)短,結(jié)構(gòu)簡單,多以二分裂方式進(jìn)行繁殖的原核生物,是在自然界分布最廣、個體數(shù)量最多的有機體,是大自然物質(zhì)循環(huán)的主要參與者。

自然界存在多種多樣病菌,如何將這些病菌加以鑒別、分類,并選擇有效藥物進(jìn)行治療這是很重要的問題。革蘭氏染色法的意義就在于鑒別細(xì)菌,把眾多的細(xì)菌分為兩大類,革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。常見的革蘭氏陽性菌有:葡萄球菌、鏈球菌、肺炎雙球菌、炭疽桿菌、白喉桿菌、破傷風(fēng)桿菌等;常見的革蘭氏陰性菌有痢疾桿菌、傷寒桿菌、大腸桿菌、變形桿菌、綠膿桿菌、百日咳桿菌、霍亂弧菌及腦膜炎雙球菌等。

1.2 熱原

熱原系指由微生物產(chǎn)生的能引起恒溫動物體溫異常升高的致熱物質(zhì)。它包括細(xì)菌性熱原、內(nèi)源性高分子熱原、內(nèi)源性低分子熱原及化學(xué)熱原等。這里所指的“熱原”,主要是指細(xì)菌性熱原,是某些細(xì)菌的代謝產(chǎn)物、細(xì)菌尸體及內(nèi)毒素。

熱原具耐熱性、濾過性、水溶性、不揮發(fā)性。熱原最主要特性為耐熱性,其為由磷脂、脂多糖和蛋白質(zhì)所組成的復(fù)合物,存在于細(xì)菌的細(xì)胞和固體膜之間。脂多糖是內(nèi)毒素的主要成分,具很強的熱原活性。熱原分子量越大致熱作用也越強。

注入人體的注射劑中含有熱原量達(dá)1μg/kg就可引起不良反應(yīng),發(fā)熱反應(yīng)通常在注入1小時后出現(xiàn),可使人體產(chǎn)生發(fā)冷、寒顫、發(fā)熱、出汗、惡心、嘔吐等癥狀,有時體溫可升至40℃以上,嚴(yán)重者甚至昏迷、虛脫,如不及時搶救,可危及生命。該現(xiàn)象稱為“熱原反應(yīng)”。

《中國藥典》2005年版規(guī)定熱原檢查采用家兔法,細(xì)菌內(nèi)毒素檢查采用鱟試劑法。

1.3 熱原和細(xì)菌內(nèi)毒素的關(guān)系

熱原的結(jié)構(gòu)成分,目前國內(nèi)外仍未有統(tǒng)一的認(rèn)識,但從國內(nèi)外文獻(xiàn)報道中,一個共同的意見,都普遍認(rèn)為:它是指細(xì)菌內(nèi)毒素的脂多糖。

歐洲藥典委員會副主席J.Van Noordw ijk提出:“嚴(yán)格地講,不是每一種熱原都具有脂多糖的結(jié)構(gòu),但所有已知的細(xì)菌內(nèi)毒素脂多糖都有熱原活性”。

細(xì)菌內(nèi)毒素與熱原相關(guān),內(nèi)毒素是藥品熱原檢查不合格的主要原因。在 GM P條件下,藥品生產(chǎn)的質(zhì)量控制一般可以接受的觀點是:無內(nèi)毒素即無熱原,控制內(nèi)毒素就是控制熱原,這也是藥典普遍采用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法代替熱原檢查法的依據(jù)。

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法因其靈敏、準(zhǔn)確、快速和經(jīng)濟等優(yōu)點,越來越多被用于控制藥品注射劑質(zhì)量。

1.4 細(xì)菌內(nèi)毒素和細(xì)菌外毒素

一般細(xì)菌毒素可分為兩類,一類為外毒素(Exotoxin),它是一種毒性蛋白質(zhì),是細(xì)菌在生長過程中分泌到菌體外的毒性物質(zhì)。產(chǎn)生外毒素的細(xì)菌主要是革蘭氏陽性菌。

另一類為內(nèi)毒素,是革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁外壁層上的特有結(jié)構(gòu)。內(nèi)毒素的主要化學(xué)成分是脂多糖中的類脂A成分。

1.5 細(xì)菌內(nèi)毒素的計量單位EU

目前國際公認(rèn)細(xì)菌內(nèi)毒素量值 EU,一般來說1EU大致等于0.1～0.2ng。

關(guān)于細(xì)菌內(nèi)毒素的量值在以前幾乎都是以重量單位來表示它很不科學(xué),相同重量的內(nèi)毒素,由于菌株來源不同,提取方法各異而且所加附形劑不同,其生物活性相差很大。如EC-2和EC-5,其重量換算單位分別:5EU/ng和10EU/ng,隨著人們對內(nèi)毒素生物活性認(rèn)識的不斷提高,以效價單位表示內(nèi)毒素的量值是十分合理的。

1.6 細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測

細(xì)菌內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁成分,當(dāng)細(xì)菌死亡或自溶后便會釋放出內(nèi)毒素。因此,細(xì)菌內(nèi)毒素廣泛存在于自然界中。如自來水中含內(nèi)毒素的量為1至100EU/m l。當(dāng)內(nèi)毒素通過消化道進(jìn)入人體時并不產(chǎn)生危害,但內(nèi)毒素通過注射等方式進(jìn)入血液時則會引起不同的疾病。內(nèi)毒素小量入血后被肝臟枯否細(xì)胞滅活,不造成機體損害。

內(nèi)毒素大量進(jìn)入血液就會引起發(fā)熱反應(yīng)—“熱原反應(yīng)”。因此,生物制品類、注射用藥劑、化學(xué)藥品類、放射性藥物、抗生素類、疫苗類、透析液等制劑以及醫(yī)療器材類(如一次性注射器,植入性生物材料)必須經(jīng)過細(xì)菌內(nèi)毒素檢測試驗合格后才能使用。

1956年美國人Bang發(fā)現(xiàn)美洲鱟血液遇革蘭氏陰性菌時會產(chǎn)生凝膠。其后Levin和Bang發(fā)現(xiàn)微量革蘭氏陰性菌內(nèi)毒素也可以引起凝膠反應(yīng),從而創(chuàng)立了鱟試劑檢測法。由于鱟試劑法簡單﹑快速﹑靈敏﹑準(zhǔn)確,目前已廣泛用于臨床、制藥工業(yè)藥品檢驗等方面。

在美國,鱟試驗被稱作為細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(Bacterial Endotoxin Test)收載于1980年20版美國藥典。隨后英、德、意、日以及中國相繼在藥典中收載了這一檢查法。此后鱟試驗逐漸替代家兔熱原試驗。

2 細(xì)菌內(nèi)毒素的去除

細(xì)菌內(nèi)毒素的去除主要有:(1)高溫法(2)酸堿法(3)吸附法(4)離子交換法(5)凝膠過濾法(6)反滲透法(7)超濾法。

內(nèi)毒素不是蛋白質(zhì),因此非常耐熱。在100℃的高溫下加熱1h也不會被破壞,只有在160℃的溫度下加熱2-4h,或用強堿、強酸或強氧化劑加溫煮沸30min才能破壞它的生物活性。

在無菌原料藥生產(chǎn)企業(yè)中主要采用干熱滅菌和濕熱滅菌去除細(xì)菌內(nèi)毒素,原料藥液采用活性炭吸附法。主要采用中

活性炭對熱原有較強的吸附作用,且有助濾脫色作用,在注射液生產(chǎn)中被廣泛使用,但使用時用量一定要視原料質(zhì)量、藥液澄明度和其本身質(zhì)量而定,一般為溶液總量的0.1%～1%?；钚蕴渴侨コ裏嵩囊环N有效手段,但是在使用中要根據(jù)不同的情況確定其使用方式。

3 原料藥生產(chǎn)企業(yè)無菌生產(chǎn)車間去除細(xì)菌內(nèi)毒素的方法

在無菌原料藥生產(chǎn)企業(yè)中,大致有結(jié)晶法,凍干法生產(chǎn)各種無菌原料藥。生產(chǎn)青霉素,頭孢類無菌原料藥多采用共沸結(jié)晶,溶媒結(jié)晶法,無菌室中的設(shè)備主要有結(jié)晶罐,抽濾,離心或是罐式三合一進(jìn)行固液分離,然后采用雙錐,罐式三合一或是單錐干燥,手工分裝或是自動分裝的成品。

部分頭孢,氨芐西林,羥丙基-β-環(huán)糊精等以水為介質(zhì)采用凍干法生產(chǎn)無菌原料藥。

3.1 結(jié)晶法無菌室控制細(xì)菌內(nèi)毒素的方法

3.1.1 原材料檢驗(以頭孢類為例)

主要原材料頭孢××酸是細(xì)菌內(nèi)毒素的攜帶者,主要原因有可能是合成頭孢的重要原料媒法生產(chǎn)7-ACA過程中帶入的。另一個需要及時監(jiān)控的是注射用水,純化水雖不控細(xì)菌內(nèi)毒素指標(biāo),但要定期進(jìn)行檢測作為參考數(shù)據(jù)進(jìn)行記錄。檢測指標(biāo)要符合客戶要求的指標(biāo)。

3.1.2 生產(chǎn)過程控制

(1)有些品種生產(chǎn)時溶配時所用注射用水使用電子秤稱量,未走管道,有被污染的可能性。

(2)溶配罐在上一批次投料完成后,料液壓進(jìn)無菌室后進(jìn)行清洗,清洗后要干燥罐內(nèi),防止潮濕的環(huán)境滋生細(xì)菌。在長時間不使用后使用前檢測細(xì)菌內(nèi)毒素。

(3)過濾系統(tǒng)的濾芯的滅菌。濾芯在使用前要進(jìn)行濕熱滅菌,以除去細(xì)菌內(nèi)毒素。從濕熱滅菌柜中拿出到過濾器安裝點路途遠(yuǎn),注意保護(hù),否則易被污染。

(4)過濾系統(tǒng)的清洗。過濾器的濾殼應(yīng)使用5%的堿液處理。濾芯安裝應(yīng)注意防護(hù),如穿潔凈服,帶手套等。

(5)過濾系統(tǒng)的清洗。在一個批次的料液壓進(jìn)無菌室后,要對濾芯使用注射用水進(jìn)行清洗,一般從溶配罐接水經(jīng)過過濾器進(jìn)入到無菌室的設(shè)備中。要注意接到溶配罐中的注射用水沒有被污染,同時是否使用80℃水直接洗。在清洗過程中注意濾芯材質(zhì),不要被破壞。洗過后應(yīng)立即過下一批料,如果還有時間間隔,可以采用相應(yīng)溶媒浸泡保護(hù),直到過下一批料液。

(6)無菌室中結(jié)晶罐的清洗。在結(jié)晶完成一批料液后,使用注射用水進(jìn)行清洗,清洗后要立即干燥罐內(nèi),直到接下一批次料液。如果等待下一批次料液時間較長,要定時間檢測細(xì)菌內(nèi)毒素。

(7)無菌室中過濾設(shè)備的清洗。在過濾完成一批料液后,使用注射用水進(jìn)行清洗,清洗后要干燥設(shè)備,或是使用75%酒精淋洗,控干備用。

(8)無菌室中干燥設(shè)備的清洗。在干燥完成一批料后,使用注射用水進(jìn)行清洗,清洗后要干燥設(shè)備,或是使用75%酒精淋洗,控干備用。

(9)無菌室中使用工器具的清洗。在完成分裝操作后,使用注射用水進(jìn)行清洗,清洗后要干燥設(shè)備,或是使用75%酒精淋洗,控干備用。

(10)衣服,眼鏡,手指菌落,維修工具以及長時間放置在無菌室中的用具等物品要及時檢測。長時間放置在無菌室中的出粉用眼鏡,小維修或是拆卸工具,放置一段時間要及時檢測。經(jīng)常用水洗的物品器具要做定期檢測,減少污染的可能性。

(11)經(jīng)過濕熱滅菌的物品如衣物,膠圈,西林瓶塞等注意保證滅菌時間,出濕熱滅菌柜后的物品不應(yīng)是濕的。

(12)無菌室中注射用水濾芯的檢查清洗。有些無菌室中的注射用水沒有直接與設(shè)備連接,而是采用U型彎后接一個過濾器,過濾后在接到設(shè)備上,目的是消除注射用水中的可見異物,但是這樣一來,U型彎后到設(shè)備的一段管路成為了死水點,如不及時檢測,清理,更換濾芯,易滋生細(xì)菌。

(13)一般無菌室的粗洗間純化水,注射用水用水點放在一起,混用,水池子應(yīng)及時清洗,檢測。有些自動洗瓶機與注射用水U型彎連接管路較長,是一個死水點,使用前應(yīng)放水清理。

(14)無菌室中現(xiàn)場衛(wèi)生的保持。在結(jié)晶法的無菌室中有很多控制柜,開關(guān),儀表線,防爆按鈕,防爆電話等等,還會有很多溶媒管道,還有許多管道支撐件,鋼平臺,包了電機的不銹鋼操作面,所以造成的死角很多,要及時清理,擦拭。

(15)無菌室中使用注射用水清理房間,地面衛(wèi)生后定期檢測細(xì)菌內(nèi)毒素。

(16)進(jìn)入無菌室中人員衛(wèi)生保持。進(jìn)入更衣室應(yīng)洗澡,換衣。進(jìn)入一更應(yīng)洗臉,手,眼鏡,鼻腔,口腔等部位,脫襪子后應(yīng)洗腳,換鞋,避免帶入灰塵,帶入更多的細(xì)菌。

(17)純化水檢測細(xì)菌內(nèi)毒素指標(biāo)作為參考。要注意微生物限度數(shù)值的變化,如果微生物限度在消毒后好一些,逐漸高,可能系統(tǒng)有問題。

3.1.3 生產(chǎn)前清洗

生產(chǎn)線在生產(chǎn)前要使用5%的堿液洗滌設(shè)備管道,在安裝好過濾系統(tǒng),加料系統(tǒng)后,要采用純蒸汽滅菌。確保設(shè)備,管路沒有任何死角。

3.2 凍干法無菌室控制細(xì)菌內(nèi)毒素的方法:

3.2.1 原材料檢驗

凍干法沒有辦法去除細(xì)菌內(nèi)毒素,這就要求不帶入更多的細(xì)菌內(nèi)毒素,所以從源頭控制非常關(guān)鍵。所用原料至少要符合客戶要求的細(xì)菌內(nèi)毒素指標(biāo)。其他同結(jié)晶法。

3.2.2 生產(chǎn)過程控制

(1)凍干前往往完成成鹽反應(yīng),所以前序的純化水,注射用水中細(xì)菌內(nèi)毒素指標(biāo)非常關(guān)鍵,并注意不能被污染。

頭孢類:在投料之前,溶解間的設(shè)備要用5%的堿液處理,之后沖洗至中性后立即使用,溶配罐在上一批次投料完成后,料液壓進(jìn)無菌室后進(jìn)行清洗,清洗后要干燥罐內(nèi),防止潮濕的環(huán)境滋生細(xì)菌。在長時間不使用后使用前檢測細(xì)菌內(nèi)毒素。

羥丙基-β-環(huán)糊精:前期反應(yīng)在12%左右的堿性環(huán)境中進(jìn)行,后又經(jīng)過酸堿樹脂柱處理,所以前期不關(guān)鍵,關(guān)鍵點在進(jìn)凍干機之前的濃縮,確保濃縮機使用前使用合適的試劑浸泡納濾膜(長時間不使用不被染菌),然后就是快速進(jìn)入凍干機凍干產(chǎn)品。之后濃縮機要立即進(jìn)行清洗,洗凈羥丙基-β-環(huán)糊精,減少細(xì)菌滋生的環(huán)境,若長時間不使用,要用合適的試劑浸泡納濾膜。

(2)過濾系統(tǒng)的濾芯的滅菌。濾芯在使用前要進(jìn)行濕熱滅菌,以除去細(xì)菌內(nèi)毒素。從濕熱滅菌柜中拿出到過濾器安裝點路途遠(yuǎn),注意保護(hù),否則易被污染。

(3)過濾系統(tǒng)的清洗。過濾器的濾殼應(yīng)使用5%的堿處理。濾芯安裝應(yīng)注意防護(hù),如穿潔凈服,帶手套等。

(4)過濾系統(tǒng)的清洗。在一個批次的料液壓進(jìn)無菌室后,要對濾芯使用注射用水進(jìn)行清洗,在下一個批次料液過濾之前采用純蒸汽走濾芯管道,對整個管道到加料槍進(jìn)行蒸汽濕熱滅菌處理。

(5)凍干機,凍干盤,無菌膜的處理。凍干機,不銹鋼凍干盤可以采用5%的堿液處理,注射用水洗至中性控干后立即使用?，F(xiàn)在凍干產(chǎn)品多使用無菌膜制作凍干盤凍干產(chǎn)品,減少了使用不銹鋼凍干盤易造成金屬屑的可見異物問題,但是,無菌膜進(jìn)入無菌室一定要做好消毒,一般使用紫外燈,臭氧燈結(jié)合消毒,但要注意細(xì)菌內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌死后產(chǎn)生的,所以控制源頭非常關(guān)鍵。

(6)凍干產(chǎn)品一般都要混粉,所以一般都配有混分器,所以,對混分器,磨粉,分裝設(shè)備也要注意定期清理。

(7)其他同3.1章節(jié)的(9)～(17)。

3.2.3 生產(chǎn)前清洗

生產(chǎn)前清洗同3.1.3章節(jié)。

4 結(jié)論與討論

(1)細(xì)菌內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁個層上的特有結(jié)構(gòu),內(nèi)毒素只有當(dāng)細(xì)菌死亡溶解或用人工方法破壞菌細(xì)胞后才釋放出來,主要化學(xué)成分為脂多糖中的類脂A。在 GM P條件下,藥品生產(chǎn)的質(zhì)量控制一般可以接受的觀點是:無內(nèi)毒素即無熱原,控制內(nèi)毒素就是控制熱原。

(2)內(nèi)毒素跟無菌是兩個概念,但稍有聯(lián)系。無菌不合格,不一定內(nèi)毒素不合格。原料藥(如羥丙基-β-環(huán)糊精)有注射級這一說法,也就是指沒有無菌的要求,但是有細(xì)菌內(nèi)毒素的要求,用于生產(chǎn)最終滅菌的產(chǎn)品。但是無菌合格的產(chǎn)品也可能含有熱原。

(3)生產(chǎn)過程中從源頭開始的每一步控制細(xì)菌內(nèi)毒素非常關(guān)鍵,0.22μm過濾可以除菌不可以除細(xì)菌內(nèi)毒素?？刂萍?xì)菌內(nèi)毒素要從源頭控制,到最后的無菌室是不能根本解決的。

(4)制劑或者原料藥除熱原最常規(guī)工藝就是過炭,活性炭是去除細(xì)菌內(nèi)毒素的有效方法,但是活性炭是否可以完全除去熱原,沒有任何報道說絕對可以。同時由于活性炭成分復(fù)雜,也會帶入到成品中,所以活性炭可以防止并除去熱原,主要是原輔料、水、容器中不要帶入熱原,從源頭上盡量減少熱原帶入的可能性。

熱原一般用活性炭吸附除去,常溫,高溫需要根據(jù)所生產(chǎn)產(chǎn)品而定,如果不適合用炭吸附,可用分子過濾(超濾)。

(5)超濾(U ltra Filtration縮寫UF),超濾的孔徑在0.001-0.05μm。主要分離對象是水體中的膠體物質(zhì)、大分子物質(zhì)(如蛋白質(zhì))、細(xì)菌、病毒等微生物。對于分子量小于1000的樣品都可以使用超濾法來除內(nèi)毒素,不過藥物有損失。超濾雖然可行,但對分子大小及溶液粘度有較大的選擇性。注意要對膜進(jìn)行試驗幾次,密理博和PALL公司生產(chǎn)的膜雖說標(biāo)稱的分子量相同,但有時試驗的結(jié)果卻差很遠(yuǎn)。

A brief analysisabout how to control endotoxin of sterile product

(CSPC Shijiazhuang Gaoke M edical Technology Development Co.L td,Shijiazhuang Hebei052160,China)

The thesis discusses the relevant issues of the endotoxin,and its relationship w ith the pyrogen and bacteria.Based on the specific conditions in the sterile room of asep tic active pharmaceutical ingredient,analyze the key points of endotoxin generation,endotoxin elimination methods,and p rovide the suggestions fo r the management of endotoxin in the injection p roducts of the asep tic manufacturing facility.

Endotoxin;Bacteria;Pyrogen

HUWen-bin

R954

:A

1001-9383(2010)04-0057-05

2010-07-20

胡文濱(1969-),男,河北懷安人,工程師,主要從事抗生素產(chǎn)品研發(fā)工作.