邵文武,張 輝

(佳木斯大學(xué),黑龍江 佳木斯 154007)

目前我國(guó)肝硬化的發(fā)病率呈上升趨勢(shì),已經(jīng)嚴(yán)重危害人民身心健康。肝纖維化是許多肝臟疾病發(fā)展的中間環(huán)節(jié)[1],最后會(huì)發(fā)展為肝硬化。因而早期診斷,治療肝纖維化具有極其重要的臨床意義,屬于當(dāng)今醫(yī)學(xué)界重點(diǎn)研究課題之一[2]。本文作者用 Wistar大鼠成功建立肝纖維化模型,為進(jìn)一步研究肝纖維化的發(fā)病機(jī)制、早期診斷和治療方法等奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性 Wistar大鼠90只,體重約200g,由佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。分為 5組 ,正常對(duì)照組10只,模型組 4組,各20只。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

飼養(yǎng)7d,實(shí)驗(yàn)采用無(wú)不良反應(yīng),飲水、飲食以及活動(dòng)正常者。給予膽總管結(jié)扎 ,時(shí)間分別是 24h、 48h、 96h、168h。結(jié)扎后乙醚麻醉大鼠,處死動(dòng)物后立即取肝臟。肝組織標(biāo)本以中性福爾馬林溶液固定、石蠟包埋,進(jìn)行常規(guī) HE染色和直接免疫熒光法染色,分別用光學(xué)顯微鏡和熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果

2.1 肝纖維化模型的成功率

80只大鼠制模成功68只,建模成功率高達(dá) 85.0%。其中,第24小時(shí)模型組死亡1例,建模成功率為95%,第 48小時(shí)模型組死亡 2例,建模成功率為90%,第96小時(shí)模型組死亡4例 ,建模成功率為 80%,第 168小時(shí)模型組死亡 5例 ,建模成功率為75%,模型組大鼠肝纖維化形成隨著時(shí)間的增加,愈發(fā)典型。

2.2 病理組織學(xué)觀察

正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰,呈正常肝組織結(jié)構(gòu)。BDL24h后,門脈區(qū)域的膽小管內(nèi)腔擴(kuò)張明顯,在 48h后膽小管上皮細(xì)胞增多,同時(shí)門脈區(qū)域間質(zhì)發(fā)現(xiàn)有腫脹變化。96h后可見到門脈區(qū)域擴(kuò)大以及增殖的膽小管上皮細(xì)胞周圍的間質(zhì)細(xì)胞有顯著增多。168h后可以觀察到在肝實(shí)質(zhì)內(nèi)有膽小管的大量增殖。大鼠 HE染色中可見肝組織病變區(qū)域多,面積大,假小葉形成。168h免疫熒光顯示在匯管區(qū)附近有膠原沉積。

3 討論

肝纖維化的病理改變是肝內(nèi)沉積過(guò)度的細(xì)胞外基質(zhì),多數(shù)慢性肝病人都有不同程度的肝纖維化,其中大約有30%～40%會(huì)發(fā)展成為肝硬化甚至肝癌。因此,治療肝纖維化就成為治療慢性肝病中的一個(gè)關(guān)鍵問題[3]。建立比較好的肝纖維化動(dòng)物模型,對(duì)開展肝纖維化基礎(chǔ)研究有極其重要的意義,可以為臨床對(duì)肝纖維化進(jìn)行早期診斷、早期治療提供相應(yīng)的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù),具有重要的臨床意義和價(jià)值。近幾年來(lái),通過(guò)不同的實(shí)驗(yàn)方法誘導(dǎo)不同類型的肝纖維化模型,已經(jīng)取得了可喜的成就。主要有膽總管結(jié)扎法、四氯化碳、血清制品、重金屬、二甲基亞硝胺、硫代乙酰胺、酒精及復(fù)合因素的建立模型方法[4]。膽總管結(jié)扎術(shù)是誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型中較為廣泛應(yīng)用的技術(shù),該模型在肝纖維發(fā)生相關(guān)的組織學(xué)、生物化學(xué)、細(xì)胞和分子改變等方面具有最好的特性。本實(shí)驗(yàn)采用膽總管結(jié)扎術(shù)模型復(fù)制方法,既可有效形成肝纖維化模型,同時(shí)建模時(shí)間又比較短,而且建模成功率高達(dá)85.0%。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示膽總管結(jié)扎術(shù)96h和168h模型組大鼠肝功能明顯受損傷,膠原纖維面積密度明顯增加,匯管區(qū)大量纖維組織增生,較粗的纖維間隔伸入肝組織內(nèi),形成大小不等的假小葉。另外,在建模失敗死亡的大鼠尸檢中發(fā)現(xiàn),組織學(xué)觀察見肝細(xì)胞大面積壞死伴有中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),嚴(yán)重感染為模型組大鼠的死亡原因。因此,在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保持嚴(yán)格的無(wú)菌操作以及防止感染是保證建模成功的重要因素。本實(shí)驗(yàn)成功地建立了大鼠肝纖維化模型,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)做了鋪墊,也為深入研究診斷以及治療肝纖維化提供了理想的動(dòng)物模型。

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[2] 楊舜民,周玲玲,張良,等.紫七軟肝對(duì)四氯化碳所致慢性肝纖維化大鼠的肝保護(hù)作用 [J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2002,18(6):345-346

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[4] Tsukamoto H,Matsuoka M,French SW.Experimental models of hepatic fibrosis:a review.[J].Semin Liver Dis,1990,10(1):56-65