楊海龍，栗玉珍，黨 林

· 論 著 ·

銀屑病皮損中VEGF、bFGF的表達及與微血管密度的相關性研究

楊海龍，栗玉珍，黨 林

目的探討血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及堿性成纖維細胞生長因子(bFGF) 在銀屑病患者皮損血管生成機制中的作用。方法采用免疫組化法檢測尋常型銀屑病患者皮損處VEGF、bFGF及微血管密度（MVD）的表達情況，并與正常皮膚進行比較分析。結果尋常型銀屑病患者皮損處VEGF、bFGF的表達及MVD值明顯高于正常對照組（P＜0.05），VEGF與bFGF在銀屑病患者皮損中的表達差異有顯著相關性（P＜0.05）。結論VEGF及bFGF可能引起銀屑病患者皮損處血管增生，VEGF與bFGF在銀屑病微血管增生過程中發(fā)揮正性調(diào)節(jié)作用且具有協(xié)同促進性。

銀屑??；血管生成；血管內(nèi)皮生長因子；堿性成纖維細胞生長因子；微血管密度

[J Pract Dermatol, 2010, 3(2):65-68]

銀屑病皮損處最先發(fā)生的病理改變是血管的分布和形成異常[1]，作為一種與血管生成相關的疾病，對銀屑病的血管生成機制的研究現(xiàn)已成熱點，特別是一些血管生成相關因子日益受到重視。而對于血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）二者在銀屑病發(fā)病中的共同作用機制，目前卻少有進一步的實驗研究。本實驗以尋常型進行期銀屑病患者及正常人皮膚為研究對象，采用免疫組化方法，觀察其皮損處VEGF及bFGF的表達情況，并對二者與銀屑病皮損處的微血管異常增生的關系進行比較分析，探討VEGF及bFGF在銀屑病皮損處的微血管異常中發(fā)揮作用的情況。

1 材料與方法

1.1 研究對象

尋常型進行期銀屑病患者28例，來自哈爾濱醫(yī)科大學附屬二院皮膚科，其中男15例，女13例；年齡范圍15～65歲，平均42.1歲；病程6個月～20年，平均4.2年；皮損面積6%～40%。符合以下標準：①兩周內(nèi)未使用糖皮質(zhì)激素、維A酸類藥物局部治療者；②八周內(nèi)未系統(tǒng)使用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑者；③無其他系統(tǒng)性疾病及免疫功能缺陷者?；顧z取材0.6cm×1.0cm大小皮損，軀干15例，上肢5例，下肢8例。

15例對照組正常人皮膚來自哈醫(yī)大二院整形美容科門診手術室，其中游離植皮修復術6例（腹部4例，下肢2例），下瞼松弛整形術4例，面部除皺術5例，入選者均排除全身系統(tǒng)性疾病。

所有標本經(jīng)固定、包埋后，3μm切片，取一張做蘇木素-伊紅染色，備普通病理用。

1.2 主要試劑

抗VEGF抗體（兔抗人單克隆抗體，工作液），抗CD34抗體（鼠抗人單克隆抗體，工作液），免疫組化通用型兩步法檢測試劑盒PV6000，均購自北京中杉生物技術有限公司，抗bFGF抗體（兔抗人多克隆抗體，1: 200）購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.3 實驗方法

免疫組化兩步法（PicTure?）按試劑盒操作說明進行，PBS緩沖液代替一抗作陰性對照。

1.4 結果判定

VEGF和bFGF 細胞有棕黃色顆粒視為染色陽性。采用半定量計分法判定[2]。按著色程度評分，無著色=0，淺黃色=1，棕黃色=2，棕褐色=3。按陽性細胞所占比例評分，＜20%=0，20%～50%=1，50%～80%=2，＞80%=3。按以上2項指標的積分和分為4級，（-）為0～1分，（+）為2分，（++）為3～4分，（+++）為5～6分。

CD34與MVD計數(shù) CD34定位于血管內(nèi)皮細胞，陽性者被染成棕色。MVD的測定參考Weidner等[3]方法進行，即先在低倍鏡（100×）下掃視整片，尋找高密度血管區(qū)，確定微血管最密集的3個視野，然后在高倍鏡（400×）下計數(shù)每一個視野下的微血管數(shù)目。取3個視野計數(shù)結果的均數(shù)為該切片的微血管密度值。

1.5 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)采用SPSS15.0/PC軟件進行統(tǒng)計分析，VEGF、bFGF結果采用等級資料比較的秩和檢驗，CD34采用小樣本t 檢驗，VEGF、bFGF及CD34間表達相關性分析采用Spearman等級相關及Kendall等級相關分析，以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 VEGF的表達

VEGF在銀屑病患者皮損中主要表達于角質(zhì)形成細胞胞漿，為細胞內(nèi)顆粒狀棕黃色染色，VEGF表達幾乎遍布表皮全層，但以棘層染色最強，基底層細胞染色明顯減弱或不染色，真皮淺層浸潤的部分炎癥細胞胞漿內(nèi)亦可見到陽性表達。血管內(nèi)皮細胞可見少量表達（圖1）。在正常人皮膚中VEGF亦有表達，但表達弱，表皮層以基底層及棘層細胞為主（圖2），結果顯示，VEGF在銀屑病中的表達高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（u =28，P＜0.01）。

2.2 bFGF的表達

bFGF在銀屑病患者皮損中主要表達于角質(zhì)形成細胞漿，定位于表皮基底層和棘層下部，為棕黃色或黃色，真皮少量表達于真皮淺層的血管，位于血管壁和血管周圍，為黃色或淡黃色。毛囊、成纖維細胞和淋巴細胞亦有不規(guī)則表達（圖3）。正常人皮膚中bFGF表達于表皮的基底層，黃色或淡黃色，真皮表達位置與銀屑病組一致，呈弱表達（圖4），bFGF在銀屑病中的表達高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（u=103，P＜0.01）。

2.3 CD34的表達

CD34 陽性染色表達位于血管內(nèi)皮細胞的胞漿，形成條狀或環(huán)狀，呈彌漫分布，在正常對照組及銀屑病患者的皮損真皮層血管內(nèi)皮細胞均有CD34 表達（圖5，6），銀屑病患者MVD 計數(shù)（22.02±5.57）顯著高于正常對照組MVD計數(shù)（4.62±2.28），差異有統(tǒng)計學意（t =14.420，P＜0.01）。

2.4 相關性分析

VEGF與bFGF在銀屑病患者皮損中的表達差異有相關性（r =0.4，P＜0.05）（表1），VEGF與MVD差異有相關性（r =0.346，P＜0.05）， bFGF與MVD差異有顯著相關性（r = 0.434，P＜0.01）（表2）。

表1 銀屑病皮損VEGF與bFGF的相關性分析

表2 銀屑病皮損VEGF、bFGF的表達與MVD的相關性

3 討論

VEGF是一種作用最強，且唯一能特異性作用于內(nèi)皮細胞的有絲分裂原，它不僅可以促進真皮血管內(nèi)皮細胞分裂增生，還可以增加血管通透性，并對炎癥細胞、內(nèi)皮細胞有化學趨化作用。筆者的實驗表明，銀屑病皮損處VEGF表達明顯增加，這與Detmar等[4]報道相一致。在正常人皮膚中也有一定量的VEGF表達，主要分布于表皮基底層和毛囊外毛根鞘部位，此處的VEGF可能以旁分泌作用調(diào)節(jié)皮膚血管的自身平衡[4]。最近有報道[5]將編碼VEGF的基因轉入小鼠皮膚可致銀屑病樣改變，包括特征性血管變化、表皮變化和炎性細胞浸潤，這進一步表明VEGF 可能在銀屑病發(fā)病過程中起重要作用。

圖1 銀屑病皮損處VEGF的表達

圖2 正常皮膚VEGF的表達

圖3 銀屑病皮損處bFGF的表達

圖4 正常皮膚bFGF的表達

圖5 銀屑病皮損處CD34的表達

體外培養(yǎng)表明正常皮膚中主要是角質(zhì)形成細胞分泌VEGF，而銀屑病的角質(zhì)形成細胞和成纖維細胞均可分泌大量的VEGF。有報道，由角質(zhì)形成細胞分泌的VEGF對于銀屑病皮損部血管異常起著決定作用，可加重銀屑病皮損處的炎癥反應，促進銀屑病的病理過程，且進行期皮損的真皮乳頭層微血管內(nèi)皮細胞上可見有VEGF受體KDR和FLT-1 的表達，而正常皮膚則無[6,7]。

bFGF是一種能促進細胞增殖和血管生成的多功能細胞因子，現(xiàn)已證明其在體內(nèi)外對內(nèi)皮細胞有促分裂和趨化作用，能刺激內(nèi)皮細胞產(chǎn)生膠原酶和纖維蛋白酶，降解基底膜，并誘導毛細血管內(nèi)皮細胞向三維膠原基質(zhì)中遷移，形成毛細血管樣腔狀結構[8,9]。

在多種腫瘤細胞中，bFGF常呈過度表達, 參與促進瘤細胞增殖和血管生成的病理過程[10]。在表皮腫瘤、脂溢性角化病、基底細胞上皮瘤和鱗狀細胞癌等中均可見bFGF蛋白的表達。本實驗中，bFGF在銀屑病表皮中陽性表達程度顯著高于正常人皮膚表皮層，基底層最明顯，這一研究結果與Arbiser等[11]用免疫組化法檢測bFGF在銀屑病表皮的表達定位基本一致?；讓邮钦Ｈ似つw組織中增殖和代謝最活躍的部位，bFGF在此部位的高表達表明其可能對角質(zhì)形成細胞的增殖、分化起一定作用。bFGF不僅高表達于銀屑病皮損表皮，亦少量表達于真皮異常增生的微血管，提示bFGF高表達在銀屑病中的作用可能與它們在腫瘤與新生血管中的作用一樣,都促進了血管增生。

Bequet-Romero等[12]在試驗中發(fā)現(xiàn)bFGF對VEGF的表達具有調(diào)控作用，而本研究中，銀屑病皮損處二者表達相關性也提示bFGF可能是通過上調(diào)VEGF及其受體的表達而間接促進了血管生成，這說明VEGF與bFGF在銀屑病中促血管生成方面能起一定的協(xié)同作用。但VEGF與bFGF在銀屑病中促血管生成方面發(fā)揮協(xié)同作用的具體調(diào)控機制及與其它血管生成相關因子間的相互作用還有待于進一步深入研究探討。

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Study on correlation between expression of VEGF, bFGF and MVD in the psoriatic lesions

YANG Hai-long，LI Yu-zhen，DANG Lin
Department of Dermatology, The Fifth Affliated Hospital of Harbin University, Daqing 163316, China

ObjectiveTo investigate the effect of VEGF and bFGF in the mechanism of the angiogenesis of psoriasis vulgaris.MethodsThe expression of VEGF, bFGF and MVD from samples of psoriasis vulgaris tissue was examined by immunohistochemistry. Then, compared with those of skin tissue from healthy individuals.ResultsThe expression of VEGF, bFGF and MVD in psoriasis vulgaris tissue was significantly higher than those in the normal group (P＜0.05). There was a significant correlation between the expression of VEGF and that of bFGF (P＜0.05).ConclusionVEGF and bFGF possibly may cause angiogenesis in psoriatic lesion. VEGF and bFGF play positive role in regulating and facilitating synergy in the process of proliferation of microvessels in psoriasis.

Psoriasis；Angiogenesis；Vascular endothelial growth factor；Basic fibroblast growth factor；Microvessel density

R758.63

A

1674-1293(2010)02-0065-04

楊海龍

2010-03-06

2010-04-05）

（本文編輯 敖俊紅）

163316 大慶，哈爾濱醫(yī)科大學附屬五院皮膚科（楊海龍）；哈爾濱醫(yī)科大學附屬二院皮膚科（栗玉珍，黨林）

楊海龍，男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：銀屑病

E-mail: yhlyhl1976@163.com

作者簡介：栗玉珍，E-mail: liyuzhen@medmail.com.cn