黃新蓉 劉劼

副衣原體的生物學(xué)特征及分離培養(yǎng)的研究進(jìn)展

黃新蓉 劉劼

副衣原體是1997年初從2例女性阿米巴感染者鼻黏膜中分離出來的細(xì)胞內(nèi)共生微生物?，F(xiàn)有的證據(jù)表明副衣原體是引起人類呼吸道感染的重要病原體。因此，其分離培養(yǎng)對研究其致病機(jī)制以及快速診斷具有重要的意義。本文就近年來有關(guān)副衣原體的生物學(xué)特征、分離培養(yǎng)方法以及快速診斷方面的研究進(jìn)展作一綜述。

1 副衣原體的分類

除眾所周知的經(jīng)典衣原體家族外，最新發(fā)現(xiàn)的衣原體家族成員有：副衣原體科(parachlamydiaceae)，西門坎氏菌科(Simkaniaceae)和石德菌科(Waddliaceae)。目前研究表明，副衣原體科主要分為棘阿米巴副衣原體(parachlamydia acanthamoeba PA)和哈氏變形蟲新衣原體(Neochlamydia artmanellae NH)兩個(gè)屬。副衣原體自然感染阿米巴，與衣原體屬的復(fù)制周期相似，16SrRNA的同源性為80%～90%[1]。

2 副衣原體的形態(tài)學(xué)

副衣原體和其他衣原體一樣，具有獨(dú)特的發(fā)育周期，即原體(elmentary body EB)和網(wǎng)狀體(reticulate body RB)，其中RB代謝相對活躍，但無感染性[2-3]。Greub G[2]等在共同培養(yǎng)PA菌株UWC1和活性淤泥時(shí)，用電鏡觀察到副衣原體UV-7位于UWC1空泡中。其中EB直徑約為0.3～0.5μm，RB輕微增大，直徑約為0.5～0.7μm，不同的菌株原體和網(wǎng)狀體直徑相差比較大。

近年Gilbert等用多食棘阿米巴Linc-AP1與Bn9和Hall，s球菌分別在PYG培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)，分別于8、36和144h用電子顯微鏡進(jìn)行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有5例多食棘阿米巴滋養(yǎng)體被PA感染，同時(shí)在阿米巴內(nèi)、外均可觀察到新月體，推測其主要功能是延長潛伏期。另外，還可以用SAMBA軟件對新月體進(jìn)行形態(tài)和定量分析，對多食棘阿米巴內(nèi)副衣原體的生命周期進(jìn)行量化分析[3]。隨后Greub G[4]等的研究進(jìn)一步證實(shí)PA可能存在第三種發(fā)育階段—新月體期，此階段很少被觀察到，可能是副衣原體的這個(gè)生長發(fā)育階段不具有明顯的特征，新月體在其他衣原體屬中并未發(fā)現(xiàn)。

3 副衣原體宿主的選擇

眾所周知自生生活阿米巴(Free-living amoebae FLA)是細(xì)菌共生生物[2]，而副衣原體是主要胞內(nèi)寄生物之一。研究證實(shí)副衣原體難以在無細(xì)胞的純培養(yǎng)基內(nèi)生長，從而可證明此類細(xì)菌為專性的胞內(nèi)共生體，副衣原體比較合適的宿主是棘阿米巴，并且極易與棘阿米巴共生，將其作為復(fù)制的載體，且具有在不同棘阿米巴中復(fù)制增殖的能力[5]。

4 副衣原體菌株感染宿主細(xì)胞

1995年Kahane等開拓了在實(shí)驗(yàn)室使用細(xì)胞培養(yǎng)污染物的新領(lǐng)域。早期的研究一般不用哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)副衣原體，但近來越來越多的實(shí)驗(yàn)證明副衣原體菌株能在多種細(xì)胞中存活。第一例報(bào)告是Berg17在Vero細(xì)胞中成功培養(yǎng)，但目前Bn9和Hall’s菌株在Vero細(xì)胞中尚未成功培養(yǎng)[5]。另外，Bn9菌株在McCoy細(xì)胞，P388D1巨噬細(xì)胞和人類胚胎成纖維細(xì)胞也未培養(yǎng)成功。以前認(rèn)為胞內(nèi)菌寄生物的宿主范圍受棘阿米巴屬限制，但近來研究表明副衣原體UV-7不受宿主UWE1的限制，可入侵哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如Vero，Hela和NCI-H292細(xì)胞。通過檢測呼吸道標(biāo)本16S rRNA基因序列獲得的CorvenA4[6]，將其標(biāo)本感染Vero和Hela細(xì)胞培養(yǎng)尚未有成功的報(bào)道。除此之外，副衣原體還可以感染人類肺泡壁細(xì)胞(A549)和肺成纖維細(xì)胞(HEL)，并在其中進(jìn)行復(fù)制。

5 副衣原體分離培養(yǎng)

目前可以從環(huán)境樣本和臨床標(biāo)本檢測和分離獲得PA。環(huán)境樣本主要有土壤、活性淤泥、淡水、海水等。包括人類呼吸道標(biāo)本、眼角膜組織、腦組織和皮膚病灶、粥樣硬化斑塊和外周血單個(gè)核細(xì)胞等[7]。

Gilbert[1]等證實(shí)目前分離阿米巴中的副衣原主要有兩種方法。一是將臨床標(biāo)本直接在PAS(Page’s modified Neff’s amoeba saline)中培養(yǎng)，PAS是一種專門用于阿米巴培養(yǎng)的培養(yǎng)基，其特點(diǎn)是培養(yǎng)基中無營養(yǎng)成分，能抑制臨床標(biāo)本中污染物的過度生長。阿米巴最佳生長溫度為30～35℃，需培養(yǎng)數(shù)天或幾周，培養(yǎng)過程中需要定期檢查有無阿米巴分解或Gimenez陽性球菌的出現(xiàn)。另一種方法是將臨床標(biāo)本接種至無營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(100mlPAS培養(yǎng)液中加入1.5g瓊脂)，再覆蓋一層60℃熱滅活1小時(shí)的大腸桿菌[8]，于25-30℃培養(yǎng)。

先前的PA的分離培養(yǎng)最大的缺點(diǎn)是費(fèi)時(shí)[2]，近年來比較熱門和實(shí)用的方法是采用共同培養(yǎng)的方法獲得環(huán)境樣本菌株。Astrid[2]等對工業(yè)廢水治理工廠中的活性淤泥(activated sludge)與未感染副衣原體的棘阿米巴標(biāo)準(zhǔn)株UWE1進(jìn)行共同培養(yǎng)，成功獲得一株新的副衣原體命名為UV-7。經(jīng)鑒定UV-7的16S rRNA序列與PA的同源性為98.7%。

6 副衣原體分離培養(yǎng)的影響因素

研究證實(shí)抗生素、溫度和發(fā)病率等對副衣原體的分離培養(yǎng)有影響。Maurin[4]等發(fā)現(xiàn)PA對慶大霉素較為敏感，使用此氨基甙類抗生素有可能阻礙副衣原體的俘獲。大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類抗生素及磺胺類藥物等也會(huì)抑制副衣原體的生長，故不能在培養(yǎng)基中添加上述抗生素。另一方面，棘阿米巴對生長條件的耐受性遠(yuǎn)大于其它的阿米巴(如納氏蟲屬阿米巴)，對溫度要求也不嚴(yán)格，可在37℃左右很好的存活[7]，但是在培養(yǎng)含有胞內(nèi)菌的棘阿米巴時(shí)，孵育期間的溫度一般在32℃左右，高溫下阿米巴非常容易形成囊胞，而且在大于32℃的時(shí)候副衣原體易誘導(dǎo)阿米巴發(fā)生溶胞[1]。冷凍可能會(huì)造成衣原體的活力喪失，但添加2%～10%胎牛血清可以減少失活率。

再者，雖然大量血清學(xué)和分子學(xué)研究證據(jù)證實(shí)副衣原體可引起吸入性肺炎和社區(qū)獲得性肺炎，還可引起下呼吸道感染(細(xì)支氣管炎和支氣管炎)，但是同時(shí)也證實(shí)副衣原體DNA在支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本中檢測結(jié)果非常罕見(約為0.083%)。

7 結(jié)論與展望

目前迫切需要從臨床標(biāo)本和環(huán)境樣本中成功分離培養(yǎng)出PA菌株及發(fā)現(xiàn)未知的且同源性較高的新種類。分離培養(yǎng)出PA菌株對進(jìn)一步證實(shí)PA的致病性、致病機(jī)制、快速診斷等均具有十分重大的意義。尋找除共同培養(yǎng)方法、PCR檢測16S rRNA基因特異性基因序列以外更好、更快捷的培養(yǎng)及檢測方法。

[1]Greub G,Raoult D.Parachlamydiaceae:potential emerging pathogens.Emerg Infect Dis.2002 Jun,8(6):625-630.

[2]Greub G,Raoult D.Parachlamydiaceae:potential emerging pathogens.Emerg Infect Dis,2002,8(6):625-630.

[3]Corsaro D,Venditti D,Le Faou A,Guglielmetti P,Valassina M.A new chlamydia-like 16S rDNA sequence from a clinical sample.Microbiology,2001,147(Pt 3):515-516.

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[5]Greub G,Raoult D.Crescent bodies of Parachlamydia acanthamoeba and its life cycle within Acanthamoeba polyphaga:an electron micrograph study.Appl Environ Microbiol,2002,68(6):3076-3084.

[6]Casson N,Posfay-Barbe KM,Gervaix A,Greub G.New diagnostic real-time PCR for specific detection of Parachlamydia acanthamoebae DNA in clinical samples.J Clin Microbiol,2008,46(4):1491-1493.

[7]Schuster FL.Cultivation of pathogenic and opportunistic freeliving amebas.Clin Microbiol Rev.2002 Jul,15(3):342-354.

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10.3969/j.issn.1009-4393.2010.14.022

421001 湖南省衡陽市南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所 (黃新蓉 劉)