吳曉勇 李冬云 陳信義 王瑞曇 岳明 程玥 張曉雙 張恩戶

CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)是一群表型和功能特異的T細(xì)胞亞群，在維持機體自身免疫耐受中起重要作用，它具有免疫抑制和免疫無能的特性[1-3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Treg細(xì)胞數(shù)量減少或功能缺失可導(dǎo)致自身免疫性疾病。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，免疫性血小板減少性紫癜(immune th rombocy topenic purpura，ITP) 是一種自身免疫性疾病，其發(fā)病與免疫失調(diào)關(guān)系密切[4-7]。為探討Treg細(xì)胞及TGF-β1與ITP的發(fā)病關(guān)系以及益髓顆粒對ITP的免疫調(diào)節(jié)機制，我們通過血清免疫法建立與人類發(fā)病機制類似的ITP動物模型，并以益髓顆粒進行干預(yù)，用流式細(xì)胞術(shù)和ELISA法分別檢測ITP小鼠脾臟Treg細(xì)胞及血清TGF-β1的變化。

1 材料

1.1 動物 Balb/C小鼠，SPF級，體重為18～22克，8周齡，雌雄各半，共40只，購于第四軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心，動物合格證號：SCXK(軍)2007-007；豚鼠，3月齡，雌性，購于西安市長安區(qū)斗門實驗動物養(yǎng)殖場，動物合格證號：SCXK(陜)2007-002；動物飼養(yǎng)和實驗均在陜西中醫(yī)學(xué)院SPF級動物實驗室進行，許可證號：SYXK(陜)2007-006。

1.2 藥物 益髓顆粒系北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院制劑，由北京勃然制藥有限公司代加工(京藥制字Z20053081)；醋酸潑尼松片系浙江仙琚制藥股份有限公司產(chǎn)品(5m g/片，國藥準(zhǔn)字H 33021207，批號：080202)。

1.3 試劑 Freund’s Com p lete Ad juvant(FCA) and Freund’s Incomp lete Ad juvant(FICA)，Sigm a 公司產(chǎn)品；辣根過氧化物酶標(biāo)記重組蛋白A(Protein A/HRP)，北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；Mouse Regu latory T cell Stain ing K it(FITC an ti-m ouse CD4，PE anti-m ouse CD25 PECy5 an ti-m ouse Fox p3, PE-Cy5 Rat IgG2a isoty pe control，A ffinity purified anti-mouse CD16/32(Fc Block))，eBioscience 產(chǎn)品；ELISA K it for Mouse TGF-β1(批號：0810272)，上海西唐科技生物有限公司產(chǎn)品。

1.4 儀器 SCW-CJ型超凈工作臺，蘇州宏瑞凈化科技有限公司生產(chǎn)；3111型恒溫培養(yǎng)箱，美國Form a公司產(chǎn)品；L-530離心機，湖南賽特湘儀離心機有限責(zé)任公司生產(chǎn)；702超低溫冰箱，美國電熱公司；FACSCalibur流式細(xì)胞儀，美國Becton Dicknson公司；ELX808IU酶標(biāo)儀，美國Bio-TEK。

2 方法

2.1 GP-APS制備及效價測定 取Balb/C小鼠，5%戊巴比妥鈉麻醉，眼球取全血，EDTA-Na2抗凝，離心分離血小板，調(diào)整血小板數(shù)至1×109/m l；取分離的血小板分別與等量FCA和FICA混合成油包水狀做好抗原，取含F(xiàn)CA抗原1m l于0周注射于豚鼠足掌、背及皮下至少四點，取含F(xiàn)ICA抗原1m l分別于l，2，4周注射于豚鼠足掌、背及腹部皮下，每次至少四點，第5周從豚鼠心臟取不抗凝全血，離心分離血清即為GP-APS，分裝貯存于-20℃冰箱；ELISA法檢測GP-APS效價，設(shè)陰性對照，用Protein A/HRP代替堿性磷酸酶-蛋白A酶標(biāo)抗體，用酶標(biāo)儀在490nm處測吸光度(OD值)，大于或等于陰性對照孔OD值2倍即為GP-APS陽性；將GP-APS從-20℃中取出，56℃水浴30m in，用等量Balb/C小鼠紅細(xì)胞吸附兩次，用生理鹽水稀釋成1:4濃度GP-APS待用。

2.2 建模與分組 40只Balb/C小鼠按外周血小板計數(shù)隨機分為正常組、模型組、潑尼松治療組及益髓顆粒治療組，每組10只。正常組常規(guī)飼養(yǎng)，其余各組參考文獻[8-11]造模方法并加以改進，隔日一次按100μl/20g腹腔注射1：4稀釋的GP-APS，造模第8天開始各組均按0.2m l/10g體積灌胃，其中正常組、模型組灌服生理鹽水，酸潑尼松組按0.0113mg/10g體重灌服溶解液；益髓顆粒治療組按0.3g/10g體重灌服益髓顆粒稀釋液；每日1次，連續(xù)8天。

2.3 觀察指標(biāo)與檢測方法

2.3.1 脾Treg細(xì)胞 脫頸處死小鼠，無菌取脾，研磨，過200目篩網(wǎng)，用冷PBS 洗滌2次，1000r/m in離心10m in，RPM I1640重懸細(xì)胞，制備脾單細(xì)胞懸液為1×107/m l；取脾單細(xì)胞懸液100μl，加0.125μg FITC-CD4，0.06μgPE-CD25，4℃反應(yīng)30m in，用預(yù)冷的染色緩沖液洗滌1次，加新配制的固定/破膜液1m l，旋渦混勻，4℃避光60m in，加2m l破膜液離心，棄上清2次，加Fc Block1μg/test，4℃避光15m in，加0.5μg PE-Cy5 Foxp3抗體，避光4℃孵育30m in，加2m l破膜工作液離心，棄上清2次，用適量的染色緩沖液重懸細(xì)胞，以CD4和SSC設(shè)門，F(xiàn)CM檢測。

2.3.2 血清TGF-β1 ELISA法檢測，96孔酶標(biāo)板分設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔、空白孔、待測樣品孔。(1)分別加標(biāo)準(zhǔn)品、樣品稀釋液、待測樣品100μl，37℃120m in，洗板5次，甩干；(2)加生物素化的抗小鼠TGF-β1 100μl，37℃60m in，洗板同前；(3)加HRP標(biāo)記的親和素100μl，37℃30m in，洗板同前；(4)加底物工作液(TMB)100μl，37℃避光15m in，加終止液100μl，用酶標(biāo)儀在450nm處測吸光值(OD值)。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所有樣品孔OD值均減除空白孔值后計算TGF-β1含量。

3 結(jié)果

模型組Treg、TGF-β1水平明顯降低，與正常組比差異顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義，潑尼松及益髓顆粒治療Treg、TGF-β1水平較模型組有所提升，差異顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義，但Treg仍未達到正常水平，與正常組比仍存在差異，而TGF-β1與正常組比差異不明顯，無統(tǒng)計學(xué)意義。檢測結(jié)果見表1。

4 討論

1995年Sakaguch i等發(fā)現(xiàn)在正常人和小鼠外周血及脾臟組織的CD4+T細(xì)胞中有一亞群持續(xù)高表達IL-2受體α鏈(CD25)，并將其命名為CD4+CD25+Treg細(xì)胞[12]。該細(xì)胞是一種新型的免疫抑制細(xì)胞，在維持機體自身免疫耐受中起重要作用，具有免疫抑制和免疫無能的特性[1-3]，在經(jīng)TCR介導(dǎo)的信號刺激活化后不僅能抑制CD4+和CD8+T細(xì)胞的活化和增殖，還能抑制其免疫功能，且這種免疫抑制不具有MHC局限性，能夠抑制同種型或同種異型T細(xì)胞的增殖[13-14]。Treg也可通過分泌至細(xì)胞外或表達于細(xì)胞表面的TGF-β發(fā)揮免疫抑制作用。TGF-β具有抑制抗原遞呈細(xì)胞及拮抗效應(yīng)性T細(xì)胞的功能，在Treg細(xì)胞介導(dǎo)的免疫耐受及Treg細(xì)胞的產(chǎn)生和增殖中發(fā)揮重要的作用[15-18]。有研究表明，多種自身免疫性疾病存在CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)量和功能上的異常[19-21]。有研究發(fā)現(xiàn)，ITP患者Treg細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子TGF-β1的水平顯著低于緩解患者和健康志愿者，且其抑制功能也出現(xiàn)明顯障礙，證實Treg細(xì)胞數(shù)量減少和功能缺陷可能為ITP免疫紊亂的機制之一[22-24]。

表1 益髓顆粒對ITP小鼠脾臟CD4+CD25+Foxp3+Treg、血清TGF-β1水平的影響(±s)

表1 益髓顆粒對ITP小鼠脾臟CD4+CD25+Foxp3+Treg、血清TGF-β1水平的影響(±s)

注：與正常組比，●P＞0.05，△P＜0.05，△△P＜0.001；與模型組比，★P＜0.05，★★P＜0.001。

組別 n CD4+CD25+Foxp3+Treg(%) TGF-β1(pg/m l)正常對照組 10 8.82±1.86 892.91±41.25模型對照組 9 5.14±1.50△△ 754.01±64.19△△潑尼松組 10 6.37±1.86△★ 839.63±74.33●★★益髓顆粒組 10 6.72±1.85△★ 867.70±83.17●★★

益髓顆粒由炙黃芪、黨參、生熟地、當(dāng)歸等組成，具有“益氣養(yǎng)陰，活血止血”功效，作為制劑已在醫(yī)院應(yīng)用20余年，對骨髓增生異常綜合征(M yelodysp lastic Synd rom es，MDS)具有良好的治療效果。其療效機制是：對MDS患者免疫機制失調(diào)具有調(diào)節(jié)效能，故進行拓展用于ITP的臨床治療，其顯示度在于：該藥能提升血小板數(shù)、緩解巨核系病態(tài)造血[25-26]。本研究通過血清免疫法建立與人類發(fā)病機制類似ITP動物模型，并用益髓顆粒進行干預(yù)治療，以證實該藥物是否對ITP有免疫調(diào)節(jié)作用。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組小鼠外周脾臟Treg細(xì)胞及血清TGF-β1水平明顯低，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。經(jīng)干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，潑尼松、益髓顆粒治療組Treg細(xì)胞及血清TGF-β1水平明顯高于模型組，具有統(tǒng)計學(xué)意義。實驗結(jié)果提示：ITP小鼠Treg細(xì)胞比例下降，由此導(dǎo)致細(xì)胞免疫抑制功能缺陷，自身反應(yīng)性T細(xì)胞活化；同時，Treg細(xì)胞減少，抑制性細(xì)胞因子分泌水平下降，抑制功能進一步減弱，不能有效的發(fā)揮免疫抑制作用，導(dǎo)致激活的T淋巴細(xì)胞增多，輔助B細(xì)胞產(chǎn)生自身抗體，使血小板破壞增加。實驗結(jié)果證實，益髓顆?？商岣逫TP小鼠Treg細(xì)胞的比例及血清TGF-β1水平，推測其可能在調(diào)節(jié)免疫功能紊亂和治療身免疫性疾病存在作用靶點。促進Treg細(xì)胞免疫抑制功能也許是其作用機制之一。

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