王小明，劉 平

(1、萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院，江西 萍鄉(xiāng) 337055；2、重慶醫(yī)科大學(xué)，重慶 400014)

乙型肝炎由乙型肝炎病毒 (Hepatitis B Virus，HBV)引起的是世界性傳染病，主要通過(guò)血液、血制品、性傳播及母嬰傳播，是引起肝硬化和肝癌的常見病因。乙型肝炎病毒表面抗體(HBsAb)是乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg刺激機(jī)體產(chǎn)生的特異性抗體，是機(jī)體對(duì)乙肝病毒產(chǎn)生免疫力的保護(hù)性抗體，在肝炎或注射疫苗后產(chǎn)生，是機(jī)體對(duì)乙肝病毒產(chǎn)生抵抗力的標(biāo)志[1-3]。通過(guò)對(duì)血清或者血漿中HBsAb的檢測(cè)，可用于監(jiān)測(cè)乙肝疫苗的效果評(píng)估或是對(duì)乙肝患者病情轉(zhuǎn)歸的觀察?，F(xiàn)行的酶聯(lián)免疫法(ELISA)在臨床實(shí)驗(yàn)室廣為使用，但存在不能定量的缺點(diǎn)，不能及時(shí)提醒HBsAb低滴度人群再次接受疫苗免疫。而放射免疫法(RIA)存大有效期短，操作繁瑣，環(huán)境污染，線性范圍窄等缺點(diǎn)?；瘜W(xué)發(fā)光免疫測(cè)定(CLIA)是一種具有廣闊發(fā)展前景的非放射標(biāo)記微時(shí)定量測(cè)定技術(shù)[4-5]，國(guó)外已成功應(yīng)用，2000年以來(lái)，國(guó)內(nèi)一些生物公司也相繼研發(fā)出了各種化學(xué)發(fā)光定量測(cè)定試劑盒，本研究旨在建立乙型肝炎病毒表面抗體 (HBsAb)化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 純化HBsAg購(gòu)自美國(guó)Fitzgerald 公司；ALP， NaIO4，NaBH4，乙二醇購(gòu)自 Sigma 公司；Abbott AxSYM系統(tǒng)及配套試劑為美國(guó)雅培公司；HBsAb國(guó)家定量參考品 (0408-871)和PANEL(0408)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；96孔白色化學(xué)發(fā)光板購(gòu)自NUNC公司；化學(xué)發(fā)光免疫分析儀器(BHP9504)購(gòu)自北京源德生物工程有限公司；標(biāo)本為空腹靜脈采血4～5ml，分離血清，-20℃保存。

1.2 固相抗體制備 將純化HBsAg單抗用50mmol/L Na2CO3-NaHCO3pH 9.6緩沖液稀釋至10mg/L的包被液，微孔板各孔加100μl，37℃包被2h，洗板3次，再以1%BSA 37℃封閉2h，板條密封后置-20℃冷凍保存。

1.3 HBsAg-ALP標(biāo)記物的制備 10mg HBsAg用0.05mol/L碳酸緩沖液透析至pH9.6，10mg ALP用NaIO40.5mg于 2～8℃活化 1h，用 20μl乙二醇終止，以0.05mol/L碳酸緩沖液透析8h。將活化的ALP與透析后的HBsAg混勻，2～8℃反應(yīng)2h。再加0.5mg硼氫化鈉(NaBH4)還原。以0.05mol/L碳酸緩沖液透析24h，其中換液三次，加50%體積甘油于-20℃保存。

1.4 HBsAb定標(biāo)品的制備 篩選多份HBsAb強(qiáng)陽(yáng)性血清，混勻，離心及過(guò)濾，加入0.2%NaN3，以HBsAb國(guó)家定量參考品 (濃度分別為 160、106.7 71.1、47.4、31.6、21.1、14、9.4m IU/ml) 標(biāo)定混合血清HBsAb含量，再以標(biāo)定好的混合血清以新生牛血清配制成 2000、500、100、20、5、0 m IU/ml，按 1m l/管分裝，-20℃保存。

1.5 發(fā)光底物液的配制 配制0.05mol/L的Tris-HCl(pH 9.6)，加入 0.002mol/L的 MgCl2，滅菌。 按 1:10比例加入增強(qiáng)劑Sapphire-II，再加入0.5mol/L金剛烷(AMPPD),2～8℃存放。

1.6 測(cè)定方法 采用雙抗原夾心法，即在包被有HBsAg的96孔白色微孔板上，每孔依次加入20μl HBsAb定標(biāo)品或待測(cè)血清，100μl以反應(yīng)緩沖液1:1000稀釋的HBsAg-ALP標(biāo)記物，37℃孵育30min后，用洗滌液洗滌5次，拍干。加入100μl發(fā)光底物液后第10～20min內(nèi)測(cè)定各孔的相對(duì)發(fā)光值(RLU)。

1.7 數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)處理 由儀器自帶軟件繪制HBsAb濃度—RLU的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)待測(cè)樣品RLU值，由定量軟件直接計(jì)算轉(zhuǎn)換成其相應(yīng)的HBsAb含量。

2 結(jié)果

2.1 靈敏度 平行測(cè)定10孔零值定標(biāo)品，以零值定標(biāo)品的RLU±2SD作為試劑的最低檢測(cè)限，得出該試劑的靈敏度為2m IU/ml。

2.2 精密性 分別用HBsAb含量為高、低的質(zhì)控品進(jìn)行精密性測(cè)定，每個(gè)質(zhì)控品測(cè)定10孔，結(jié)果批內(nèi)變異分別為6.5%、4.7%、4.4%，批間變異分別8.9%、7.3%、9.1%，見表 1。

表1 批內(nèi)批間精密性

2.3 準(zhǔn)確性 用不同濃度的血清樣品分別測(cè)試樣的添加回收率和稀釋回收率。結(jié)果添加回收率為92.3～107.6%之間，稀釋回收率為 91.7～110.4%。

2.4 特異性 經(jīng)檢測(cè)20份中檢所陰性參考品，結(jié)果全小于10m IU/ml。

2.5 穩(wěn)定性 把定標(biāo)品、HBsAg包被板、HBsAg-ALP標(biāo)記物置于37℃破壞7d后，與4℃保存試劑比較，定標(biāo)品系列的RLU平均下降到86.4%，靈敏度下降至3.45m IU/ml，其它無(wú)明顯差別。

2.6 劑量反應(yīng)曲線：5～2000m Iu/ml檢測(cè)范圍內(nèi)，HBsAb濃度—RLU的標(biāo)準(zhǔn)曲線γ=0.994，見圖1。

圖1 HBsAb濃度—RLU劑量反應(yīng)曲線

2.7 臨床符合率： 收集Abbott AxSYM系統(tǒng)檢測(cè)過(guò)的樣本213份，再以新建立的HBsAb化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)數(shù)據(jù)分析，其陰性符合率為98.1%，陽(yáng)性符合率為82.6%。且兩種檢測(cè)方法所測(cè)數(shù)值具有顯著相關(guān)性。相關(guān)方程為Y=1.0381X＋0.8751 Abbott(n=213)，相關(guān)系數(shù) γ=0.941，P＜0.001，見圖2。

圖2 本方法與Abbott系統(tǒng)檢測(cè)臨床標(biāo)本的相關(guān)性

3 討論

目前，中國(guó)大多數(shù)醫(yī)院測(cè)定乙型肝炎血清標(biāo)記物均采用ELISA法。ELISA法檢測(cè)HBsAb需要分離結(jié)合態(tài)的抗原(或抗體)與游離態(tài)的抗原(或抗體)，因此需要反復(fù)加樣和洗版，引入的誤差也就大，加上酶標(biāo)板的孔間存在差異，方法的變異系數(shù)就更大[6]。而采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)HBsAb，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示批內(nèi)批間變異系數(shù)均<10%。

另外，ELISA方法僅為定性或半定量檢測(cè)，無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)定HBsAb量；而CLIA法作為定量檢測(cè)的方法，其靈敏度高，從本次實(shí)驗(yàn)可知其檢測(cè)HBsAb的靈敏度可達(dá)2m IU/ml。WHO推薦，當(dāng)HBsAb濃度達(dá)到10m lU/ml以上時(shí)，才對(duì)機(jī)體具有保護(hù)作用。因而采用CLIA法滿足了對(duì)于臨床的指導(dǎo)作用。同時(shí)采用定量方法測(cè)定HBsAb，根據(jù)血清HBsAb含量可判斷機(jī)體對(duì)HBV的免疫狀態(tài)及乙肝疫苗的免疫效果，特別是評(píng)價(jià)全面免疫的接種效果有重要意義[7-9]。

因此，我們建立的化學(xué)發(fā)光HBsAb定量檢測(cè)方法，從現(xiàn)有的分析指標(biāo)結(jié)果來(lái)看靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)范圍寬、無(wú)放射性污染，并且操作簡(jiǎn)單、測(cè)定結(jié)果可靠，有著廣闊的應(yīng)用前景。

[1]Shepard CW,Simard EP,Finelli L,et al.Hepatitis B virus infection:epidemiology and vaccination[J].Epidemiol Rev,2006,28(5):112-125.

[2]Enomoto M,Tamori A,Nishiguchi S.Hepatitis B virus genotypes and response to antiviral therapy[J].Clin Lab,2006 52(1-2):43-47.

[3]Gish RG,Locarnini SA.Chronic hepatitis B:current testing strategies[J].Clin Gastroenterol Hepatol,2006,4(6):666-676.

[4]Kricka LJ,Stanley PE.Bioluminesence and chemiluminescence Literature[J].JBiolumin Chemilumin,1989,3(8):159-166.

[5]Kricka LJ.Ultrasensitive Immunoassay Techniques[J].Clin Biochem,1993,26(4):325-331.

[6]Milich DR,Chen MK,Hughes JL,et al.The secreted hepatitis B preeore antigen can modulate the immune response to the nucleocapsid:a mechanism for persistence[J].J Immunol,1998,160(4):2013-2021.

[7]張運(yùn)洪,秦 蘇,何靜波,等.ELISA結(jié)合MEIA測(cè)定低水平HBsAg[J].臨床檢測(cè)雜志,2002,20(2):103.

[8]陳 瑜,單谷忠.低水平血清乙肝病毒表面抗原測(cè)定及其臨應(yīng)床意思義[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2001,24(1):39-41.

[9]羅開忠,楊 旭,蘇先獅,等.時(shí)間分辨免疫熒光法檢測(cè)乙型肝炎病毒標(biāo)志物[J].中華肝臟病雜志,2003,11(9):569-569.