張周云，熊?chē)?guó)亮

(江西省胸科醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌 330006)

血清學(xué)診斷結(jié)核病人抗體已有許多報(bào)道，但大多情況不是敏感性不夠就是特異性不強(qiáng)[1]。盡管應(yīng)用免疫學(xué)技術(shù)檢測(cè)結(jié)核病抗原已有20多年的歷史，但相關(guān)檢測(cè)報(bào)道較少。近年來(lái)由于單克隆抗體制備技術(shù)的提高，取得了高效價(jià)的特異性抗體對(duì)提高結(jié)核抗原檢測(cè)的敏感性和特異性起著至關(guān)重要作用[2-3]。為了探討檢測(cè)血清中結(jié)核桿菌抗原對(duì)肺結(jié)核病的診斷價(jià)值，我們應(yīng)用單克隆抗體，采用ELISA夾心法檢測(cè)了139例臨床已確診的活動(dòng)性肺結(jié)核患者血清中結(jié)核桿菌分泌蛋白desA抗原，現(xiàn)將結(jié)果評(píng)價(jià)報(bào)告如下。

材料與方法

1材料

1.1 標(biāo)本來(lái)源 2010年2月～7月我院結(jié)核內(nèi)科139例活動(dòng)性肺結(jié)核病住院患者，其中男83例、女56例，平均年齡54.3歲；我院呼吸內(nèi)科、腫瘤科64例非結(jié)核性肺部疾病 (27例肺炎、16例慢性支氣管炎、21例肺癌)住院患者，其中男36例、女28例，平均年齡58.7歲。全部病例根椐臨床表現(xiàn)、體征、X線、CT、細(xì)菌學(xué)、細(xì)胞學(xué)、生化指標(biāo)、免疫學(xué)或抗結(jié)核治療有效等進(jìn)行了確診。所有患者均抽取空腹血分離出血清，每個(gè)患者的血清分兩部分，一部分當(dāng)天檢測(cè)，另一部分-20℃冰柜保存。29例健康對(duì)照血清來(lái)自江西省血液中心獻(xiàn)血員。

1.1 .2試劑 為鄭州安圖綠科生物工程有限公司產(chǎn)品，批號(hào)：20090813。

2方法

2.1 (1)取出一定量的包被孔，編號(hào)。留空白1孔，2孔加入陰性對(duì)照100μl，2孔加入陽(yáng)性對(duì)照 100μl，其余各孔加樣品稀釋液100μl，分別加入血清20μl。(2)在微量振蕩器上振蕩30s使孔內(nèi)液體混合均勻。(3)置37℃下溫育30min。(4)用洗板機(jī)洗板6次。(5)每孔分別加入酶結(jié)合物100μl，空白孔不加。(6)重復(fù)操作步驟(3)(4)。(7)每孔中加入底物、顯色劑各 50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光反應(yīng)10min。(8)加終止液50μl/孔，振蕩混勻，立即用酶標(biāo)儀450nm/630nm雙波長(zhǎng)測(cè)定各孔的吸光值。

2.2 結(jié)果判定

2.2 .1結(jié)果有效性 陽(yáng)性對(duì)照孔OD值應(yīng)大于0.8，陰性對(duì)照孔OD值應(yīng)小于0.1，否則實(shí)驗(yàn)無(wú)效。

2.2 .2 CUT OFF值計(jì)算 CUT OFF值=0.1+陰性對(duì)照孔平均OD值 (若陰性對(duì)照孔平均OD值小于0.05，按 0.05 計(jì)算)。

2.2 .3檢測(cè)血清OD值≥CUTOFF值時(shí)，判為陽(yáng)性，否則為陰性。

結(jié) 果

1方法學(xué)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明，新鮮血清與-20℃冰柜存放30d的血清的結(jié)核桿菌抗原檢測(cè)結(jié)果無(wú)差別。

2 139 例活動(dòng)性肺結(jié)核患者血清結(jié)核抗原檢出的敏感性為84.1%(117/139)；64例非結(jié)核性肺部疾病組結(jié)核抗原陽(yáng)性率7.81%(5/64)，特異性為92.19%，29例健康對(duì)照血清檢測(cè)全為陰性結(jié)果。詳見(jiàn)表1。

表1 二組病例及健康對(duì)照組結(jié)核抗原檢測(cè)結(jié)果

3 139 例活動(dòng)性肺結(jié)核患者痰涂片抗酸染色和痰結(jié)核桿菌培養(yǎng)結(jié)果與血清結(jié)核抗原檢出的關(guān)系，詳見(jiàn)表2。

表2 痰涂片和痰培養(yǎng)結(jié)果與血清結(jié)核抗原檢測(cè)的關(guān)系

從表中顯示，結(jié)核桿菌抗原測(cè)定陽(yáng)性與痰涂片陽(yáng)性一致率為92.73%，結(jié)核桿菌抗原陽(yáng)性與痰培養(yǎng)一致率為93.24%。

討 論

1檢測(cè)結(jié)核病患者血清結(jié)核桿菌抗原可以作為結(jié)核桿菌存在的直接證據(jù)，也可以避免結(jié)核病患者因免疫應(yīng)答低下導(dǎo)致的體液免疫檢測(cè)或細(xì)胞免疫檢測(cè)的“假陰性”結(jié)果。一段時(shí)間以來(lái)，因檢測(cè)結(jié)核抗原用的結(jié)核抗體存在交叉反應(yīng)，導(dǎo)致結(jié)核抗原檢測(cè)的特異性和敏感性低下。近年來(lái)由于單克隆抗體制備技術(shù)的提高，取得了高效價(jià)的特異性抗體，使得臨床上檢測(cè)結(jié)核病患者的血清中結(jié)核桿菌抗原成為可能。本實(shí)驗(yàn)采用的單克隆抗體是利用基因工程方法在體外表達(dá)結(jié)核分枝桿菌的desA蛋白抗原制備而成[3]，利用該單克隆抗體采用ELISA雙抗體夾心法檢測(cè)了139例臨床已確診的活動(dòng)性肺結(jié)核患者血清中結(jié)核抗原，結(jié)果表明：其敏感性為84.17%，特異性為92.19%。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，血清在-20℃條件下存放30d與新鮮血清的檢測(cè)結(jié)果無(wú)差異，有利于標(biāo)本少的實(shí)驗(yàn)室集中時(shí)間檢測(cè)。

3表2 中顯示，痰菌陽(yáng)性患者與血清結(jié)核桿菌抗原檢測(cè)陽(yáng)性的一致性很高 (涂片陽(yáng)性為92.73%，培養(yǎng)陽(yáng)性為93.24%)。對(duì)菌陰患者血清結(jié)核桿菌抗原檢測(cè)陽(yáng)性為78.57%。

4 64 例非結(jié)核性肺部疾病患者血清中有5例陽(yáng)性，查閱該5例病歷都沒(méi)有合并結(jié)核的情況，為假陽(yáng)性，因此檢測(cè)非結(jié)核性肺部疾病患者的假陽(yáng)性率為7.81%。

綜上所述，采用ELISA雙抗體夾心法檢測(cè)活動(dòng)性肺結(jié)核患者血清結(jié)核抗原雖有一定的假陽(yáng)性，但仍有可能成為結(jié)核病敏感性高、特異性強(qiáng)的新型診斷方法。檢測(cè)血清中結(jié)核桿菌分泌蛋白dseA抗原對(duì)診斷肺結(jié)核病有較高的應(yīng)用價(jià)值。

[1]劉金花,彭澤華.血清結(jié)核抗體與特異性CIC測(cè)定綜合診斷肺結(jié)核病163例[J].江西醫(yī)學(xué)檢驗(yàn),2006,24(5):441-442.

[2]唐宇龍.三種結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白的抗體制備及其在抗原檢測(cè)中的應(yīng)用[J].中國(guó)傳染病雜志,2007,25(10):597-600.

[3]顧 軍.結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白desA的單克隆抗體及其在結(jié)核病血清學(xué)診斷中的應(yīng)用[P].中國(guó)專利,200710054376.0,2008.11.12.