胡 意 ，郭 菲 ，婁遠(yuǎn)蕾 ，繆麗芳 ，陸 丹 ，汪 泱

(1、南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科；2、燒傷研究所；3、泌外研究所；4、南昌大學(xué)研究生院，江西 南昌 330006)

由于細(xì)菌感染、燒傷或創(chuàng)傷等因素可引起脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)進(jìn)入血液，激活單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，促使其釋放過量腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細(xì)胞介素類及NO等多種炎性介質(zhì)，進(jìn)而造成肝、肺、心臟、腎等組織和器官的損傷，導(dǎo)致多臟器功能不全綜合征 (multiple organ dysfunction syndrome,MODS)[1]。而Ca2+作為第二信使，在LPS的活化過程中，具有重要的信號傳導(dǎo)作用。Ca2+能夠傳遞外界刺激的信號，啟動基因轉(zhuǎn)錄，促使細(xì)胞分泌大量的炎性細(xì)胞因子[2]。本課題小組前期研究表明鑭具有結(jié)合LPS降低內(nèi)毒素毒性的作用，減輕內(nèi)毒素對機體造成的損傷[3,4]，且一定濃度氯化鑭(LaCl3)可顯著抑制LPS誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO[5]。隨著對稀土化合物生物效應(yīng)研究的深入，稀土化合物發(fā)揮生物效應(yīng)的分子機制已成為學(xué)者日益關(guān)注的課題。本研究探討LaCl3對LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞鈣信號通路激活及其釋放TNF-α的影響。

材料與方法

1 材料 氯化鑭(LaCl3·7H2O，純度99.9%，Sigma，美 國 )、LPS (Ecoli.serotype O55B5；Sigma， 美 國 )、DMEM/F12 液體培養(yǎng)基 (LPS＜0.03μmol/ml，Hyclon，美國) 和胎牛血清(LPS＜0.03μmol/ml，Gibco，美國)、流式細(xì)胞儀 (Becton Dickinson， 美國)、CO2培養(yǎng)箱(Forma， 美國)、TNF-α ELISA 試劑盒 (Diaclone，法國)，F(xiàn)luo-3/AM(Molecular Probes，美國)。

2方法

2.1 器材的準(zhǔn)備、滅菌、去熱原處理 所用玻璃器具均經(jīng)硫酸清潔液浸泡，充分洗滌后于250℃干熱消毒4h。所用塑料制品清洗干凈后用30%雙氧水浸泡4h，用三蒸水沖洗后于60℃烘干，再于120℃高壓滅菌。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 RAW 264.7細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞生物研究所。以1×106接種于去熱原培養(yǎng)瓶，以含5%胎牛血清的DME/F12液體培養(yǎng)基于5%CO2孵箱37℃培養(yǎng)。取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞隨機分成四組。LPS組：培養(yǎng)液中含1μg/m l的LPS；LaCl3+LPS組：以含2.5μmol/ml LaCl3的培養(yǎng)基培養(yǎng)一定時間后，更換為含1μg/ml LPS的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；LaCl3組：培養(yǎng)基中含 2.5μmol/ml的 LaCl3；對照組：培養(yǎng)基中不含LaCl3和LPS。按照各指標(biāo)要求與不同時間點收集細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞待測。

2.2 .1 流式細(xì)胞術(shù)測[Ca2+]i參考文獻(xiàn)[6-8，9]，取對數(shù)生長其細(xì)胞，以KRH液(130mmol/L NaCl，1.3mmol/L KCl，2.2mmol/L CaCl2，1.2mmol/L MgSO4，1.2mmol/L，KH2PO4，10mmol/L HEPES,10mmol/L 葡萄糖,pH 7.4)漂洗細(xì)胞三遍，隨后以熒光染料負(fù)載細(xì)胞(5μmol/L Fluo-3/AM于25℃孵育細(xì)胞30min)，為促進(jìn)Fluo-3溶解和細(xì)胞內(nèi)負(fù)載，同時加入20%的pluronic F-127促進(jìn)Fluo-3進(jìn)入細(xì)胞。負(fù)載結(jié)束后KRH液洗去多余熒光染料。 實驗分組同前，各組培養(yǎng)時間如下：LPS組 (LPS 1μg/ml的培養(yǎng)基培養(yǎng)2min)、 LaCl3+LPS(LaCl32.5μmol/ml的培養(yǎng)基培養(yǎng)50s后更換含LPS 1μg/ml的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2min)、LaCl3組(LaCl32.5μmol/ml培養(yǎng)50s)。取各組細(xì)胞于流式細(xì)胞儀檢測，參數(shù)設(shè)置為激發(fā)光波長488nm，發(fā)射波長526nm。按照公式計算[Ca2+]i：[Ca2+]i=Kd[(F–Fmin)/(Fmax–F)]，其中Kd為Fluo-3的解離常數(shù)(400nM)，F(xiàn)表示細(xì)胞的熒光強度，F(xiàn)min和Fmax分別為最小和最大熒光強度。Fmin是加入EGTA(終濃度3mmol/L，pH＞8.5)后測得的最小熒光值；Fmax則是加入10μmol/L A23187 Ca2+載體并使胞內(nèi)Ca2+飽和后測得。上述實驗重復(fù)三次。

2.2 .2 ELISA方法檢測 TNF-α含量 除LaCl3+LPS組(先用LaCl3培養(yǎng)24h再用LPS培養(yǎng)24h后收集培養(yǎng)上清)，其余各組細(xì)胞分別培養(yǎng)24h后取各組細(xì)胞培養(yǎng)上清。采用ELISA方法檢測TNF-α含量(具體操作按其試劑盒說明書進(jìn)行)，實驗重復(fù)三次。

2.3 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (x±s)表示，采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件對實驗結(jié)果進(jìn)單因素方差分析，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1氯化鑭對LPS激活巨噬細(xì)胞鈣信號通路的影響

流式細(xì)胞術(shù)測定結(jié)果顯示LPS組 [Ca2+]i為(336.67±26.16 nmol/L)與空白對照組 (32.33±5.51 nmol/L)比較，差異顯著(P＜0.01)；LaCl3+LPS 組[Ca2+]i為(162.67±26.41nmol/L)顯著低于LPS組及空白組(P＜0.01)；LaCl3組為(29.84±6.42nmol/L)顯著低于 LPS組(P＜0.01)，與對照組相比略低但沒有顯著差異(P＞0.05)，由此可見氯化鑭可降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度 (表1)。

表1 各組RAW264.7細(xì)胞TNF-α含量及[Ca2+]i變化比較s)

表1 各組RAW264.7細(xì)胞TNF-α含量及[Ca2+]i變化比較s)

*P＜0.01 vs.LPS 組；#P＜0.01，##P＜0.05 vs.對照組

336.67±26.16#162.67±26.41#29.84±6.42*32.33±5.51組別 TNF-α含量(pg/m l) [Ca2+]i(nmol/L)LPS組LaCl3+LPS組LaCl3組對照組152.19±15.68#43.95±6.55*27.84±3.73*##40.85±4.02

2氯化鑭對LPS激活巨噬細(xì)胞釋放TNF-α的影響

LPS組細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α含量為(152.19±15.68pg/ml)與空白對照組(40.85±4.02pg/ml)相比，顯著升高(P＜0.01)，說明LPS能刺激TNF-α的釋放，而LaCl3+LPS組細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α含量為(43.95±6.55pg/ml)，與 LPS 組相比，顯著下降(P＜0.01)且與對照組相比沒有差異，LaCl3組細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α含量(27.84±3.73pg/ml)與LPS組相比顯著下調(diào)(P＜0.01)并且與對照組相比有差異(P＜0.05)，表明氯化鑭能抑制LPS誘導(dǎo)TNF-α的釋放(表1)。

討 論

巨噬細(xì)胞是LPS侵入機體作用的主要靶細(xì)胞之一，廣泛分布于全身各個組織和器官,可分泌多種生物活性物質(zhì)調(diào)節(jié)細(xì)胞功能、參與免疫應(yīng)答。不少研究表明增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加LPS引起的感染性休克的死亡率。LPS可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi) [Ca2+]i升高，增加[Ca2+]i會促進(jìn)LPS引起的內(nèi)毒素血癥[10]，而使用Ca2+拮抗劑對內(nèi)毒素性休克具有保護(hù)作用[11]。有實驗證實鑭系元素釓可以部分阻斷大鼠椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞內(nèi)的Ca2+通道[12]。稀土離子半徑(0.096～0.115nm)與 Ca2+的半徑(0.1nm)非常接近，在生物體中通常與Ca2+結(jié)合在相同位置上，且稀土離子比Ca2+多一個正電荷，因此可以作為Ca2+在細(xì)胞和亞細(xì)胞水平發(fā)揮作用的拮抗劑[13]。課題小組曾對鑭拮抗內(nèi)毒素的體內(nèi)效應(yīng)進(jìn)行了探討，結(jié)果表明LaCl3能結(jié)合LPS降低內(nèi)毒素的毒性。本實驗則采用特異性Ca2+熒光指示劑Fluo-3/AM負(fù)載細(xì)胞，與Ca2+結(jié)合的Fluo-3在波長488nm處激發(fā),發(fā)射波長為526nm(綠色)，流式細(xì)胞儀測定其熒光強度并計算游離 [Ca2+]i，以探討鑭抑制內(nèi)毒素效應(yīng)的可能機制。實驗結(jié)果顯示，LPS攻擊后巨噬細(xì)胞內(nèi)游離[Ca2+]i明顯升高，而一定劑量LaCl3處理后的細(xì)胞內(nèi)游離[Ca2+]i明顯低于LPS組，表明LaCl3抑制了LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞內(nèi)游離[Ca2+]i的升高。

TNF-α是LPS激活單核/巨噬細(xì)胞所釋放的一種多肽類細(xì)胞因子，由于其發(fā)揮活性作用表現(xiàn)為對LPS的依賴或協(xié)同作用，故被公認(rèn)為是引起內(nèi)毒素休克、MODS及炎癥反應(yīng)的重要起始因子[14]。因此，降低TNF-α的水平是降低感染性休克死亡率的關(guān)鍵之一。我們通過本實驗發(fā)現(xiàn)LPS可明促進(jìn)巨噬細(xì)胞TNF-α的分泌，而LaCl3可顯著抑制LPS誘導(dǎo)TNF-α的釋放。由此，筆者結(jié)合課題小組前期工作[15]分析LaCl3除可能直接結(jié)合LPS，抑制LPS的活性外，還可能作為Ca2+拮抗劑影響細(xì)胞內(nèi)Ca2+流通，從而影響LPS對巨噬細(xì)胞的激活效應(yīng)，減輕LPS對機體的損傷。

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