潘長福 ，阮瓊芳 ，沈曉黎 ，涂 偉 ，婁遠蕾 ，匡助才 ，賴賢良 ，汪 泱 ，鄧志鋒*

(1、南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科；2、南昌大學(xué)泌尿外科研究所；3、南昌大學(xué)研究生院醫(yī)學(xué)部，江西 南昌 30006)

腦外傷是一種常見的致死、致殘性疾病，隨著現(xiàn)代交通工具的發(fā)展，其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢。人類海馬區(qū)神經(jīng)元與學(xué)習(xí)記憶緊密相關(guān)，但該區(qū)神經(jīng)元對腦外傷極為敏感，傷后神經(jīng)元大量變性壞死，導(dǎo)致患者學(xué)習(xí)記憶功能障礙[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，成年哺乳動物海馬齒狀回亞顆粒區(qū)(subgranular zone，SGZ)存在神經(jīng)干細胞(neural stem cells，NSCs)，這些細胞在腦外傷后被激活，增殖分化成功能上成熟的神經(jīng)元，整合到神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中，一定程度上能促進患者神經(jīng)功能的恢復(fù)[1]。但是腦外傷后NSCs增殖分化能力十分有限，遠不能達到臨床恢復(fù)的要求。因此，如何最大程度地提高神經(jīng)干細胞增殖分化能力是治療腦外傷的關(guān)鍵。近年來研究證實，notch信號表達在成體海馬區(qū)神經(jīng)干細胞中，在其增殖分化調(diào)控機制中起著極其重要的作用[2]。然而notch信號是否也調(diào)控腦外傷后神經(jīng)干細胞增殖、分化過程，目前并不清楚。本研究擬通過自由落體法復(fù)制閉合性腦外傷小鼠模型，從基因水平上觀察腦外傷后海馬區(qū)notch信號的表達變化，初步探討該信號與內(nèi)源性神經(jīng)干細胞增殖、分化的關(guān)系，為以后進一步深入研究notch信號調(diào)控成體神經(jīng)再生機制提供理論基礎(chǔ)。

材料與方法

1 實驗動物分組及模型制備 Balb/c系雄性小鼠，體重23g左右，購自南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心。隨機分為假手術(shù)(sham)組、腦外傷4h、1d、3d模型組，每組分別3只動物。參考文獻，采用改良的自由落體法復(fù)制閉合性腦外傷小鼠模型[3]。打擊裝置由腦立體定向儀、垂直導(dǎo)管、下落砝碼、頂端涂有聚乙烯的撞針組成，撞針底端直徑3mm(安徽淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司提供)。異氟烷吸入麻醉小鼠后，將頭部固定于腦立體定向儀上，消毒，沿中線切開頭皮，暴露頭蓋骨，分離骨膜，將撞針置于前、后囟門中點偏左1mm。以40g砝碼從25cm高處沿垂直導(dǎo)管自由下落，撞擊撞針造成腦損傷，縫合頭皮，給以充足水和食物喂養(yǎng)。假手術(shù)對照組僅切開頭皮，暴露顱骨，不實施打擊。傷后1h根據(jù)NSS評分系統(tǒng)(表1)評分[4]，篩選7～8分重度腦外傷小鼠納入實驗研究對象。

表1 小鼠腦損傷NSS評分系統(tǒng)

2 組織標(biāo)本制備 腦外傷組分別在傷后4h、1d、3d處死動物，顯微鏡下迅速分離傷側(cè)海馬組織，-80℃保存，以備提取總RNA。

3總RNA抽提 收集組織標(biāo)本，按Trizol試劑說明書提取總RNA。所提總RNA行紫外分光光度計檢測A260/A280在1.8～2.0之間，并計算濃度，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4實時定量RT-PCR (real-time PCR)檢測notch1、hes1mRNA 表達 取 1μg總 RNA，使用 Fermentas逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，隨機引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按以下體系進行Real-time PCR反應(yīng)：cDNA模板1μl，2×PCR mix 10μl，2μmol/L 上下游引物各 1μl，0.5μL 10×SYBR GreenI，加無菌水至 20μl，不加模板為陰性對照。將反應(yīng)管置于ABI 7500 real-time PCR system中進行擴增反應(yīng)。反應(yīng)條件如下：95℃，10min；95℃ ，15sec，60℃ 30sec 72℃ 30s for 40cycles；72℃10min。以GAPDH為內(nèi)參，假手術(shù)組海馬組織為對照組，用2-ΔΔCt值表示基因的相對表達量。Notch1 上 游 引 物 ：5＇-CCTTGGGTTCATGGATTAGTTTTG-3＇， 下 游 引 物 ：5＇-CTCAGTTGGATTTGGATGATGCT-3＇。 Hes1 上 游 引 物 ：5＇-TACCCCAGCCAGTGTCAACAC-3＇， 下游引物：5＇-TTTCCAGAATGTCTGCCTTCTCTA-3＇。

5統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。所得數(shù)據(jù)均以±s表示，進行單因素方差分析。P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

腦外傷后傷側(cè)海馬notch1和hes1 mRNA的表達變化

Real-time PCR結(jié)果顯示，腦外傷后notch1基因在傷后4h即開始升高，1d時達到高峰，較對照組升高約6倍，3d時有所回落，但仍維持在高水平，較對照組升高2倍；而hes1基因在傷后4h表達無明顯變化，1d時明顯升高，較對照組升高3倍，3d時則回落到正常水平，如圖1所示。

圖1 腦外傷后motch1、hes1 mRNA的表達

討 論

人類海馬區(qū)神經(jīng)元與學(xué)習(xí)記憶緊密相關(guān)，但該區(qū)神經(jīng)元對腦外傷極為敏感，傷后大量神經(jīng)元變性壞死，導(dǎo)致患者學(xué)習(xí)記憶功能障礙，可作為評價腦損傷嚴重程度的重要指標(biāo)之一[1]。目前研究證實，成體哺乳動物海馬齒狀回亞顆粒區(qū)存在內(nèi)源性神經(jīng)干細胞，后者是一類能自我更新，具有分化成神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞能力的細胞群。這些細胞在腦外傷后被激活，增殖分化成功能上成熟的神經(jīng)元，并整合到海馬回路中，促進患者學(xué)習(xí)記憶功能改善[1]。

Notch信號通路為調(diào)控細胞命運的基本通路[5]。在腦的發(fā)育過程中，notch信號在神經(jīng)干細胞增殖、分化過程中起著極為關(guān)鍵的作用[6,7]。激活notch信號，可維持神經(jīng)干細胞的未分化狀態(tài)[7,8]，促進其自我增殖[9]。最近研究表明，notch信號也在成年哺乳動物海馬區(qū)和室下區(qū)表達，在成體神經(jīng)再生過程中發(fā)揮著類似的調(diào)控作用[2]。Notch1為一種跨膜受體，當(dāng)其與鄰近細胞上的配體結(jié)合時，notch信號被激活，在γ-分泌酶的作用下，notch1釋放出notch胞內(nèi)區(qū)域段(Notch intracellular domain，NICD)，后者轉(zhuǎn)移至胞核內(nèi)，與DNA結(jié)合蛋白RBP-J/CSL結(jié)合，激活下游轉(zhuǎn)錄抑制因子hes1，從而發(fā)揮notch1介導(dǎo)的調(diào)控作用[10]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腦外傷后海馬區(qū)notch1 mRNA在傷后早期即開始升高，3d時仍維持在較高水平，hes1mRNA也在傷后早期升高1d，提示腦外傷可激活notch信號。而Sun、Urrea等[11-12]研究表明，腦外傷后海馬齒狀回內(nèi)神經(jīng)干細胞增殖在傷后早期即開始增殖，于2～3d時達到高峰，與傷后notch信號表達呈現(xiàn)時間上相一致的表達趨勢。由此可以推測，腦外傷后notch信號表達水平的升高可能與神經(jīng)干細胞增殖分化相關(guān)。因此進一步全面深入研究notch信號調(diào)控腦外傷后成體神經(jīng)干細胞增殖、分化機制，可為將來臨床治療提供新的可能靶點,具有十分重要的意義。

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