馮玉杰 盧偉 巖小麗 樊渝江

(四川大學(xué)國(guó)家生物醫(yī)學(xué)材料工程技術(shù)研究中心 四川 成都 610064)

雙醛普魯蘭改性膠原支架材料的制備與表征①

馮玉杰 盧偉 巖小麗 樊渝江

(四川大學(xué)國(guó)家生物醫(yī)學(xué)材料工程技術(shù)研究中心 四川 成都 610064)

用高碘酸鈉對(duì)普魯蘭進(jìn)行氧化,制備一系列雙醛普魯蘭,與膠原混合凝膠,冷凍干燥制備膠原/普魯蘭多孔復(fù)合支架材料。雙醛普魯蘭的醛基和膠原的氨基反應(yīng)形成希夫堿化學(xué)交聯(lián),交聯(lián)度隨著雙醛含量的增加而提高,其降解速率低于純膠原支架材料,且隨雙醛含量的增加而減小。細(xì)胞毒性毒性試驗(yàn)顯示復(fù)合支架材料具有良好的生物相容性。表明這種復(fù)合支架材料是一種有前景的組織工程支架材料。

雙醛普魯蘭 膠原 支架材料 降解 組織工程

膠原是人及脊椎動(dòng)物體內(nèi)含量最多的蛋白質(zhì),有良好的生物相容性及生物可降解性,同時(shí)具有低抗原性,可為細(xì)胞吸附和增殖提供必要的生物環(huán)境,已成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中應(yīng)用最廣泛的材料之一[1]。但做為植入材料,膠原有一個(gè)缺點(diǎn):在體內(nèi)膠原降解速度太快[2]。適當(dāng)?shù)慕宦?lián)反應(yīng)能提高膠原的生物穩(wěn)定性,降低其降解速率[3]。通過交聯(lián)處理,膠原將具備更優(yōu)良的性能,在組織工程支架材料上得到更廣泛的應(yīng)用。普魯蘭是無色、無味的天然高分子多糖,具有易溶于水、粘度較低、無毒副作用等特點(diǎn),作為生物醫(yī)學(xué)材料已經(jīng)有很多應(yīng)用實(shí)例[4]。用高碘酸鈉將普魯蘭多糖氧化形成醛基[5],在低溫(4℃)下可與膠原均勻混合,與膠原的氨基形成化學(xué)交聯(lián)[6],升溫到37℃可形成水凝膠,經(jīng)冷凍干燥可得到天然多糖膠原復(fù)合支架材料。利用雙醛普魯蘭多糖對(duì)膠原進(jìn)行交聯(lián),可彌補(bǔ)膠原的降解速度過快的缺點(diǎn),又可避免引入如戊二醛等有細(xì)胞毒性的交聯(lián)劑,形成具有良好生物相容性的新型復(fù)合支架材料,可望在組織工程和再生醫(yī)療領(lǐng)域應(yīng)用于細(xì)胞的三維培養(yǎng)和組織構(gòu)建。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 雙醛普魯蘭的制備

普魯蘭用純水溶解,配制成100mg/mL的水溶液,加入一定量高碘酸鈉(0.5mol/L)溶液后,用稀硫酸(0.2mol/L)調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH至3.5,于25℃遮光反應(yīng)6h,然后將反應(yīng)液透析凍干,得到雙醛普魯蘭。通過改變高碘酸鈉的加入量,制備一系列不同氧化度的雙醛普魯蘭。用FTIR對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征,用堿消耗法測(cè)定雙醛普魯蘭的醛基含量。

1.2 雙醛普魯蘭-膠原復(fù)合支架材料的制備及表征

將pH=3.0的酸性膠原溶液(0.9w/w%)用1M NaOH溶液調(diào)節(jié)至中性(膠原終濃度=0.6w/w%)后,與不同氧化度的雙醛普魯蘭溶液(2w/w%)以膠原/雙醛普魯蘭=1/0.8的質(zhì)量比于4℃攪拌混勻,靜置24h,升溫至37℃放置15min形成凝膠,用去離子水洗凈PBS鹽后冷凍干燥,制得多孔復(fù)合支架材料。

復(fù)合支架材料的交聯(lián)度由TNBS法測(cè)定。將支架材料稱重放入試管,TNBS溶液及熱反應(yīng),使支架材料中未反應(yīng)的膠原自由氨基與TNBS反應(yīng)形成可溶性復(fù)合物。6M HCl在60℃下消化支架材料使其溶解,經(jīng)稀釋后測(cè)定345nm的吸光度。測(cè)定3個(gè)平行樣取平均值。交聯(lián)度(%)=(1-交聯(lián)凝膠的吸光度/未交聯(lián)水凝膠的吸光度)×100%,吸水率由復(fù)合支架材料浸水前后的質(zhì)量計(jì)算。吸水率=(Wt-W0)/Wt×100%,降解率由支架材料浸泡在PBS(PH=7.2637℃)中隨時(shí)間延長(zhǎng),其重量的減少計(jì)算。降解率=(W0-Wt)/W0×100%。

1.3 復(fù)合水凝膠形貌觀察

將復(fù)合支架材料用刀片縱切為厚度1mm的薄片,用導(dǎo)電膠固定于掃描電子顯微鏡樣品臺(tái)上,用離子噴射儀(E-1010,HITACHI,JAPAN)表面鍍金后,用掃描電子顯微鏡(S-4800,HITACHI,JAPAN)觀察材料的形貌和孔徑分布情況。

圖1 不同醛基含量雙醛普魯蘭制備的復(fù)合支架材料的SEM圖像Figure1 Cross section SEM images of complex scaffolds derived from dialdehyde pullulan with different aldehyde content.

圖2 復(fù)合支架材料的重量損失率從上至下分別為：純膠原支架，醛基含量20%，40%，60%，80%的雙醛普魯蘭/膠原復(fù)合支架材料Figure2 Weight loss of complex scaffolds.From top to bottom:Collagen scaffold,complex scaffold containing dialdehyde pullulan with 20%,40%,60%,80% aldehyde content, respectively.

圖3 L929細(xì)胞24h和48h培養(yǎng)MTT評(píng)價(jià)Figure3 MTT assay of L929 cells after 24 and 48h culture

1.4 細(xì)胞相容性評(píng)價(jià)

將純膠原支架材料和雙醛普魯蘭/膠原復(fù)合支架材料(雙醛普魯蘭氧化度80%,60%,40%,20%)用75%酒精滅菌并用PBS反復(fù)清洗后,用無血清培養(yǎng)基在37℃浸提24h,得到材料浸提液。在96孔板中每孔加入5000個(gè)L929細(xì)胞,培養(yǎng)24h使細(xì)胞黏附良好后,吸去培養(yǎng)液,加入材料浸提液進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)24h和48h后,用MTT法測(cè)定細(xì)胞活性。以培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照。

2 結(jié)果和討論

2.1 雙醛普魯蘭多糖的制備

高碘酸鈉特異的將普魯蘭多糖的鄰雙羥基氧化成醛基。一分子雙羥基消耗一分子高碘酸鈉。通過改變高碘酸鈉與普魯蘭的比例可得到不同氧化度的雙醛普魯蘭,氧化產(chǎn)物的產(chǎn)率均在60%以上。不同高碘酸鈉與普魯蘭比例所得產(chǎn)物的醛基含量與理論值接近,當(dāng)高碘酸鈉的量增加,產(chǎn)物的醛基含量增加,由此可得到醛基含量20%～80%的一系列雙醛普魯蘭。

FTIR分析表明,雙醛普魯蘭多糖中具有大量的醇羥基(3700～3200cm和1250～1000Vc-o),同時(shí),在1730(Vc=o)和864(δc=o)處出現(xiàn)醛基的紅外吸收峰,表明普魯蘭的部分羥基經(jīng)氧化成為醛基結(jié)構(gòu)。

2.2 復(fù)合支架材料的制備與表征

雙醛普魯蘭和膠原在低溫(4℃)下可均勻地混合,形成透明的溶液。為了使醛基與膠原的氨基充分反應(yīng)交聯(lián),將混合溶液于4℃放置24h。隨后,將混合物升溫到37℃凝膠化。將凝膠冷凍干燥,即可得到多孔的膠原/普魯蘭復(fù)合支架材料。雙醛普魯蘭的醛基可與膠原的氨基間發(fā)生反應(yīng)而交聯(lián)[6]。由TNBS分析法測(cè)定膠原中未反應(yīng)的膠原氨基量,可計(jì)算交聯(lián)度。結(jié)果表明,當(dāng)雙醛普魯蘭的醛基含量由20%左右上升到40%左右時(shí),交聯(lián)度相應(yīng)的由17%上升到33%。然而,當(dāng)醛基含量進(jìn)一步升高到80%左右,復(fù)合支架材料的交聯(lián)度只提高到37%。這可能是因?yàn)榉肿又械娜┗蜌堄辔囱趸牧u基可形成半縮醛結(jié)構(gòu),消耗了相當(dāng)部分的醛基,使醛基含量較高的雙醛普魯蘭中部分醛基不能參與交聯(lián)反應(yīng)。

圖1為不同醛基含量的雙醛普魯蘭制備的復(fù)合水凝膠的斷面SEM圖像。從圖中可以看到,所有支架材料都具有相互貫穿的多孔結(jié)構(gòu),其孔徑大約為300μm左右,幾種材料之間沒有明顯的區(qū)別。這種孔徑范圍對(duì)細(xì)胞的播種和培養(yǎng)比較適宜,可以讓細(xì)胞較容易地滲透遷移到支架材料的內(nèi)部,使細(xì)胞播種均勻,從而有利于培養(yǎng)構(gòu)建工程化的活性組織。

吸水率測(cè)定結(jié)果表明,復(fù)合支架材料和吸水能力與純膠原支架材料相當(dāng),其吸水率都在98%以上,表明其具有良好的細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)通透性,適合細(xì)胞生長(zhǎng)增殖。隨著復(fù)合支架材料在PBS中時(shí)間的增加,逐漸開始降解。圖2顯示了復(fù)合支架材料的降解失重率隨PBS溶液中降解時(shí)間的變化。在最初幾天時(shí)間里,幾種支架材料之間差別不大。隨后,純膠原支架材料的降解出現(xiàn)明顯的加速現(xiàn)象,表明支架材料的結(jié)構(gòu)已經(jīng)受到一定的破壞。雙醛普魯蘭改性的復(fù)合支架材料的降解速率有明顯減小,而且隨雙醛普魯蘭中醛基含量的增加,其降解速率呈下降趨勢(shì),到14d時(shí),醛基含量80%的雙醛普魯蘭制備的復(fù)合支架材料重量損失為35%,而純膠原支架材料的重量損失為78%。與純膠原支架相比,加入雙醛普魯蘭對(duì)膠原交聯(lián),形成希夫堿結(jié)構(gòu)的復(fù)合支架更加穩(wěn)定,降解率降低,為細(xì)胞生長(zhǎng)增殖提供了更持久穩(wěn)定的空間環(huán)境。

2.3 細(xì)胞相容性

圖3為用MTT法測(cè)定的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)結(jié)果。與空白對(duì)照組相比,純膠原支架材料表現(xiàn)出一定的細(xì)胞增殖促進(jìn)作用,具有良好的生物相容性。在24h時(shí),醛基含量20%和40%的雙醛普魯蘭/膠原復(fù)合支架材料的細(xì)胞生長(zhǎng)情況與純膠原支架相似,與空白對(duì)照比較有一定的提高。醛基含量較高(60%,80%)的雙醛普魯蘭/膠原復(fù)合支架材料的細(xì)胞增殖略低于純膠原支架材料,但仍然高于空白對(duì)照,表明其對(duì)細(xì)胞增殖沒有抑制。48h后,各組復(fù)合支架材料的細(xì)胞增殖情況趨于一致,均略低于純膠原支架組,說明通過雙醛普魯蘭的交聯(lián),減少了復(fù)合支架中溶出物的量。但與空白對(duì)照組比較,各復(fù)合支架材料組的細(xì)胞增殖均略有提高,表明其具有良好的生物相容性。

3 結(jié)語

由天然普魯蘭多糖經(jīng)高碘酸鈉氧化制備的雙醛普魯蘭,其醛基和膠原的氨基反應(yīng)形成交聯(lián),與傳統(tǒng)的碳化二亞胺,戊二醛等交聯(lián)試劑相比,有利于降低支架材料的細(xì)胞毒性,是一種有用的交聯(lián)途徑。雙醛普魯蘭/膠原復(fù)合支架材料相比純膠原支架材料的降解大大減慢,提供了更長(zhǎng)久的適合細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的支架環(huán)境,可望在組織工程領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。

[1]K.A.Faraj,T.H.van Kuppevelt,W.F.Daamen.Construction of collagen scaffolds that mimic the three～dimensional architecture of specific tissues[J].Tissue Eng,2007,13:2387.

[2]S.R.Hong,M.S.Chong,S.B.Lee,Y.M.Lee,et al.Biocompatibility and biodegradation of cross～linked gelatin/hyaluronic acid sponge in rat subcutaneous tissue.J.Biomater.Sci[J].Polymer Edn,2004,15:201.

[3]N.E.Vrana,N.Builles,H.Kocak,EDC/NHS cross～linked collagen foams as scaffolds for artificial corneal stroma.J.Biomater.Sci[J].Polymer Edn,2007,18:1527.

[4]T.D.Leathers.Biotechnological production and applications of pullulan[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2003,62:468.

[5]D.Bruneel,E.Schacht.Chemical modification of pullulan:Periodate oxidation[J].Polymer,1993,34:2628.

[6]S.V.Kanth,A.Ramaraj,J.R.Rao,et al.Stabilization of type I collagen using dialdehyde cellulose[J].Process Biochemistry,2009,44:869.

Preparation and Characterization of Collagen/dialdehyde Pullulan Complex Scaffold Materials

FENG Yujie LU Wei YAN Xiaoli FAN Yujiang

National Engineering Research Center for Biomaterials,Sichuan University Chengdu 610064,China

Collagen scaffolds have been promising to provide suitable environment for 3D cell culture in tissues engineering.However,its rapid degradation and week mechanical properties remained problems that limited many of its applications.In this study,collagen/dialdehyde pullulan complex scaffolds were prepared by mixing collagen with dialdehyde pullulan with different aldehyde contents to chemically cross-link the collagen through the formation of Schiff’s base between the amino on collagen and the aldehyde on pullulan.With higher aldehyde content in pullulan,the complex scaffold thus formed showed improved degradation resistance.The MTT assay indicates that the cell proliferation on the complex scaffolds had not different with that on the pure collagen scaffold.These complex scaffolds are suitable for 3D cell culture in tissue engineering.

Dialdehyde pullulan;Collagen;Scaffold;Degradation;Tissue engineering

TB383.1

A

1674-0742(2010)07(c)-0010-03

國(guó)家863計(jì)劃重大項(xiàng)目(2006AA02A125)資助研究課題。

馮玉杰:女,碩士研究生,1984～,四川大學(xué)國(guó)家生物醫(yī)學(xué)材料工程技術(shù)研究中心,四川南充,研究方向:生物醫(yī)學(xué)材料。

2010-04-20