李 志，涂宗財(cái)*，毛沅文，姜 穎，羅曉慧，張 露

(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047)

動(dòng)態(tài)超高壓微射流技術(shù)提取甘薯葉黃酮

李 志，涂宗財(cái)*，毛沅文，姜 穎，羅曉慧，張 露

(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047)

研究動(dòng)態(tài)超高壓微射流處理熱醇提取甘薯葉黃酮的最佳工藝。以黃酮得率為考察對(duì)象，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)研究動(dòng)態(tài)超高壓微射流處理壓力、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間對(duì)甘薯葉黃酮得率的影響。結(jié)果表明：提取溫度和動(dòng)態(tài)超高壓微射流處理壓力對(duì)甘薯葉黃酮的得率影響顯著；最佳工提取藝條件為動(dòng)態(tài)超高壓微射流處理壓力100MPa、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、提取溫度75℃、提取時(shí)間120min，在此工藝條件下黃酮得率為5.75%。

甘薯葉；黃酮；動(dòng)態(tài)超高壓微射流

甘薯(Ipomoea batatas Lam.)又名紅薯、白薯、番薯、地瓜等，為旋花科甘薯屬一年生草本植物[1]。研究表明，甘薯葉中黃酮含量高于普通蔬菜，具有抗氧化、降血脂、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤等功效[2-5]。我國(guó)是世界上甘薯栽培面積最大的國(guó)家，甘薯莖葉資源豐富，但未得到充分利用，除少部分用作飼料外，大部分被丟棄，造成了資源的極大浪費(fèi)[6]。動(dòng)態(tài)超高壓微射流(簡(jiǎn)稱(chēng)微射流)是一種新興的超微細(xì)化技術(shù)，它能對(duì)物料產(chǎn)生強(qiáng)烈剪切、高速撞擊、高頻振蕩、壓力瞬間釋放等一系列的綜合作用，從而導(dǎo)致細(xì)胞破碎，而對(duì)活性成分幾乎無(wú)破壞，并且能起到很好的超細(xì)化和均一化效果[7]。目前，已有動(dòng)態(tài)超高壓微射流技術(shù)應(yīng)用于滅菌[8]、多糖提取[9]、蛋白質(zhì)改性[10-11]以及淀粉的改性[12-13]的報(bào)道。對(duì)于應(yīng)用動(dòng)態(tài)超高壓微射流提取黃酮的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以秋季甘薯收獲后的甘薯葉為原料，研究動(dòng)態(tài)超高壓提取處理提取甘薯葉中的黃酮得率的影響，為微射流技術(shù)在天然產(chǎn)物提取領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘薯葉采自南昌市郊區(qū)，50℃干燥，粉碎過(guò)200目篩備用；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥95%) 中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心；乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

M-700微射流均質(zhì)機(jī) 美國(guó)Microfluidics公司；GYB60-6S高壓均質(zhì)機(jī) 上海華東高壓均質(zhì)機(jī)廠；DFY-500型搖擺式高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 溫嶺市林大機(jī)械有限公司；T6新世紀(jì)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；JD200-3B電子分析天平 沈陽(yáng)龍騰電子有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作[14]

精確稱(chēng)取經(jīng)120℃干燥至質(zhì)量恒定的蘆丁9.1mg，用70%乙醇溶解后，移入50mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為0.182mg/mL。分別吸取標(biāo)準(zhǔn)液0.00、0.20、0.40、0.80、1.20、1.60、2.00、3.00mL于10mL容量瓶中，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% NaNO2溶液0.4mL，搖勻，放置6min，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% Al(NO3)3溶液0.4mL，搖勻，放置6min，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)4% NaOH溶液4mL，加70%乙醇至刻度，搖勻，靜置15min，于波長(zhǎng)510nm處測(cè)定吸光度，以蘆丁質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)、吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 總黃酮提取的工藝流程

甘薯葉粉→乙醚脫脂、脫色(6h)→50℃烘干(2h)→乙醇浸潤(rùn)(12h)→均質(zhì)(30MPa，均質(zhì)2次)→動(dòng)態(tài)超高壓微射流處理→熱醇回流提取→離心→抽濾→定容→測(cè)定吸光度→計(jì)算得率

1.3.3 甘薯葉黃酮得率的計(jì)算

取0.3mL提取液，同標(biāo)準(zhǔn)曲線操作，比色測(cè)定，求得黃酮質(zhì)量，并計(jì)算黃酮的得率。

1.3.4 甘薯葉黃酮提取的單因素試驗(yàn)

影響甘薯葉黃酮提取的主要因素有微射流處理壓力、微射流處理次數(shù)、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間、料液比、提取次數(shù)等。由于設(shè)備條件所限，并結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)研究，選用料液比為1:40(g/mL)，提取次數(shù)為兩次。因此，本實(shí)驗(yàn)主要考察微射流處理壓力、微射流處理次數(shù)、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間對(duì)甘薯葉黃酮提取得率的影響。

1.3.5 黃酮提取的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取對(duì)甘薯葉黃酮得率影響較大的4個(gè)因素，進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L9(34)，試驗(yàn)重復(fù)兩次。對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，確定甘薯葉黃酮提取的最佳工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：A=8.9168C-0.0006， R2=0.9998，線性范圍：0～0.06mg/mL。

2.2 微射流處理壓力對(duì)甘薯葉黃酮提取的影響

分別稱(chēng)取10.00g脫色后的甘薯葉粉，按1:40(g/mL)固液比加入體積分?jǐn)?shù)70%乙醇，浸泡12h，經(jīng)30MPa均質(zhì)后，分別在微射流壓力60、80、100、120、140MPa下處理2次，70℃水浴提取90min，提取兩次，并與相同條件下常規(guī)提取以及30MPa均質(zhì)后提取對(duì)比。

圖1 不同處理壓力對(duì)黃酮得率的影響Fig.1 Effect of microfluidization pretreatment pressure on extraction rate of flavonoids

由圖1可見(jiàn)，同常規(guī)提取和30MPa均質(zhì)后提取相比，微射流可以顯著提高甘薯葉黃酮的得率，并且隨著微射流壓力的增加黃酮得率呈上升趨勢(shì)，當(dāng)微射流處理壓力在100MPa時(shí)，得率最高；當(dāng)壓力大于100MPa時(shí)，黃酮得率有所降低，這可能是由于過(guò)高的壓力引起高頻振蕩類(lèi)似于超聲波使少量溶出的黃酮結(jié)構(gòu)破壞。因此，選擇微射流壓力100MPa。

2.3 微射流處理次數(shù)對(duì)甘薯葉黃酮得率的影響

圖2 微射流處理次數(shù)對(duì)黃酮得率的影響Fig.2 Effect of microfluidization pretreatment number on extraction rate of flavonoids

分別稱(chēng)取10.00g脫色后的甘薯葉粉，按1:40(g/mL)固液比加入體積分?jǐn)?shù)70%乙醇，浸泡12h，經(jīng)30MPa均質(zhì)后，在微射流壓力100MPa下處理1、2、3、4、5次，再經(jīng)70℃水浴提取90min，提取兩次。由圖2可見(jiàn)，在微射流100MPa下，隨著微射流處理次數(shù)的增加，甘薯葉黃酮得率逐漸升高，但經(jīng)微射流2次處理提取后，黃酮得率上升趨勢(shì)趨于平緩，對(duì)黃酮得率影響較小，而且隨著處理次數(shù)的增加，成本增加。因此，選擇微射流處理次數(shù)2次。

2.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)甘薯葉黃酮得率的影響

分別稱(chēng)取10.00g脫色后的甘薯葉粉，按1:40(g/mL)固液比加入體積分?jǐn)?shù)分別為50%、60%、70%、80%、90%乙醇，浸泡12h，經(jīng)30MPa均質(zhì)后，在微射流壓力100MPa下處理2次，再經(jīng)70℃水浴提取90min，提取兩次。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)甘薯葉黃酮得率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on extraction rate of flavonoids

由圖3可見(jiàn)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，甘薯葉黃酮得率增加，在體積分?jǐn)?shù)70%時(shí)達(dá)到最高值；當(dāng)體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加時(shí)黃酮得率下降，并且脂溶性物質(zhì)溶出增多，增加了純化除雜的難度。因此從提取效率和提取純度綜合考慮選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

2.5 提取溫度對(duì)甘薯葉黃酮提取得率的影響

分別稱(chēng)取10.00g脫色后的甘薯葉粉，按1:40(g/mL)固液比加入體積分?jǐn)?shù)70%乙醇，浸泡12h，經(jīng)30MPa均質(zhì)后，在微射流壓力100MPa下處理2次，分別用50、60、70、80、90℃水浴提取90min，提取兩次。

圖4 提取溫度對(duì)甘薯葉黃酮的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction rate of flavonoids

由圖4可見(jiàn)，溫度對(duì)甘薯葉黃酮得率的影響較大，隨著溫度的增加，甘薯葉黃酮得率增加，當(dāng)溫度達(dá)到70℃時(shí)，黃酮得率最高；隨著溫度的進(jìn)一步升高，黃酮得率有所下降，其原因可能是過(guò)高的溫度導(dǎo)致可溶性蛋白變性，使溶液黏度增加，阻礙了黃酮類(lèi)物質(zhì)的溶出，同時(shí)加速了活性成分的分解[15]，從而降低了黃酮的得率。因此，選擇最佳提取溫度70℃。

2.6 提取時(shí)間對(duì)甘薯葉黃酮得率的影響

分別稱(chēng)取10.00g脫色后的甘薯葉粉，按1:40(g/mL)固液比加入體積分?jǐn)?shù)70%乙醇，浸泡12h，經(jīng)30MPa均質(zhì)后，在微射流壓力100MPa下處理2次，再經(jīng)70℃水浴分別提取30、60、90、120、150、180min，提取兩次。

圖5 提取時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響Fig.5 Effect of extraction time on extraction rate of flavonoids

由圖5可見(jiàn)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，甘薯葉黃酮得率先增加逐漸趨于穩(wěn)定，在90～120min時(shí)，黃酮得率趨于穩(wěn)定，在120min以后黃酮得率略有下降。因此，從節(jié)約能耗和縮短生產(chǎn)周期方面考慮，選擇甘薯葉黃酮提取的最佳時(shí)間為90～120min。

2.7 正交試驗(yàn)確定甘薯葉黃酮提取的最佳工藝條件

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析Table 2 Results and range analysis of orthogonal experiments

表3 正交試驗(yàn)方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments

通過(guò)單因素試驗(yàn)分析，選擇微射流處理壓力、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間4個(gè)因素，每個(gè)因素選擇3個(gè)水平，以黃酮得率為考察指標(biāo)，選用L9(34)表設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)確定最佳提取工藝，見(jiàn)表1。

由正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)表2分析可知，試驗(yàn)因素中對(duì)甘薯葉黃酮得率影響的順序?yàn)椋篊(提取溫度)＞A(微射流處理壓力)＞B(乙醇體積分?jǐn)?shù))＞D(提取時(shí)間)。提取條件的最優(yōu)組合為A2B2C3D3，即微射流處理壓力為100MPa、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、提取溫度75℃、提取時(shí)間120min。表3方差分析結(jié)果表明，提取溫度是影響甘薯葉黃酮得率的最主要因素，其次是微射流處理壓力，兩者對(duì)甘薯葉黃酮得率影響達(dá)到顯著水平(P＜0.05)。

以微射流處理壓力100MPa、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、提取溫度75℃、提取時(shí)間120min為條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，對(duì)樣品平行提取5次，黃酮得率分別為5.74%、5.69%、5.76%、5.77%、5.81%，平均得率為5.75%，RSD為0.76%。結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)最佳工藝條件合理，同時(shí)也表明此工藝條件具有較好的重復(fù)性。

3 結(jié) 論

選取微射流處理壓力、微射流處理次數(shù)、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和提取時(shí)間為單因素，以黃酮得率為考察指標(biāo)，對(duì)黃酮的提取條件進(jìn)行研究，確定微射流處理壓力、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和提取時(shí)間為影響黃酮得率的主要因素。

通過(guò)正交試驗(yàn)確定了甘薯葉黃酮的最佳提取工藝：微射流處理壓力100MPa、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、提取溫度75℃、提取時(shí)間120min，其中提取溫度和微射流處理壓力對(duì)黃酮的得率影響顯著(P＜0.05)，在最佳提取條件下甘薯葉黃酮得率為5.75%。

[1]朱麗娜, 吳朝比, 陸英. 紅薯葉黃酮類(lèi)化合物提取工藝研究[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009, 16(7): 36-37.

[2]CARVALHO I S, CAVACO T, CARVALHO L M, et al. Effect of photoperiod on flavonoid pathway activity in sweet potato (Ipomoea batatas (L.) Lam.) leaves[J]. Food Chemistry, 2010, 118(2): 384-390.

[3]陸英, 吳朝比, 蔣華軍, 等. 紅薯葉黃酮分離純化工藝及抗氧化性研究[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(14): 114-118.

[4]羅麗萍, 高蔭榆, 洪雪娥, 等. 甘薯葉柄藤類(lèi)黃酮的抗腫瘤作用的研究[J]. 食品科學(xué), 2006, 27(8): 248-250.

[5]羅麗萍. 甘薯葉柄藤中試綜合提取的活性多糖、類(lèi)黃酮構(gòu)成及生理活性研究[D]. 南昌: 南昌大學(xué), 2006: 57-61.

[6]李文芳, 黃美娥, 唐純翼, 等. 甘薯地上部分黃酮類(lèi)化合物含量變化[J]. 天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā), 2006(18): 304-307.

[7]LIU Wei, LIU Jianhua, LIU Chengmei, et al. Activation and conformational changes of mushroom polyphenoloxidase by high pressure microfluidization treatment[J]. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 2009, 10(2): 142-147.

[8]劉成梅, 鐘業(yè)俊, 劉偉, 等. 瞬時(shí)高壓作用對(duì)谷草桿菌的殺滅模型[J].食品科學(xué), 2006, 27(6): 96-99.

[9]涂宗財(cái), 王艷敏, 劉成梅, 等. 動(dòng)態(tài)超高壓微射流技術(shù)在玉米花粉多糖提取中的應(yīng)用[J]. 食品工業(yè)科技, 2010, 31(6): 212-214.

[10]涂宗財(cái), 王輝, 劉成梅, 等. 動(dòng)態(tài)超高壓微射流對(duì)蛋清蛋白溶液的粒度和流變性影響[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(6): 27-29.

[11]涂宗財(cái), 張雪春, 劉成梅, 等. 超高壓微射流對(duì)花生蛋白結(jié)構(gòu)的影響[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào), 2008, 24(9): 306-308.

[12]涂宗財(cái), 張博, 任維, 等. 超高壓微射流對(duì)玉米淀粉機(jī)械力化學(xué)效應(yīng)的研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2008(2): 172-174.

[13]涂宗財(cái), 朱秀梅, 陳鋼, 等. 動(dòng)態(tài)超高壓微射流對(duì)糯米淀粉結(jié)構(gòu)的影響[J]. 光譜學(xué)與光譜分析, 2010, 30(3): 834-837.

[14]高麗威, 李向榮. 微波萃取法提取紫心甘薯總黃酮即其抗氧化活性研究[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 36(5): 571-574.

[15]唐浩國(guó). 黃酮類(lèi)化合物的研究[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2009: 39.

Extraction of Flavonoids from Sweet Potato Leaves by Dynamic High-pressure Microfluidization Technology

LI Zhi，TU Zong-cai*，MAO Yuan-wen，JIANG Ying，LUO Xiao-hui，ZHANG Lu
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

In order to optimize the extraction processing parameters of flavonoids from sweet potato leaves, single-factor and orthogonal experiments were used to investigate the effects of dynamic high-pressure microfluidization pretreatment pressure, ethanol concentration, extraction temperature and extraction time on extraction rate of flavonoids. Results indicated that the optimal extraction processing parameters microfluidization pressure of 100 MPa, aqueous ethanol concentration of 70%, extraction temperature of 75 ℃ and extraction time of 120 min. Under these optimal extraction conditions, the yield of flavonoids was 5.75%.

sweet potato leaves；flavonoids；dynamic high-pressure microfluidization

TS201.1

A

1002-6630(2010)24-0083-04

2010-09-21

國(guó)家科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新基金項(xiàng)目(09C26213604437)

李志(1984—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)橹参锘钚猿煞值奶崛∨c純化。E-mail：tclizhi@163.com

*通信作者：涂宗財(cái)(1965—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物開(kāi)發(fā)與利用。E-mail：tuzc_mail@yahoo.com.cn