牛蒡菊糖酶法提取

采用固定化酶法提取牛蒡菊糖。結(jié)果表明酶水解提取牛蒡菊糖的最佳工藝為：13.5g/100mL中性蛋白酶、pH 7、固液比1:15、50℃、酶水解6h，菊糖提取率為14.57%；固定化酶制備最佳工藝為：以甲醛(40%):NaOH (2mol/L)=2:3為凝結(jié)液、pH7.5、殼聚糖2.5g/100mL、60℃、加酶量7.5mg/mL，固定8h，酶活力回收率可達到39.13%；固定化酶提取牛蒡菊糖最適條件為：pH7、固液比1:15、60℃、固定化酶加入量13.5g/100mL、酶解5h，在此條件下菊糖提取率達到12.89%。固定化酶的穩(wěn)定性與游離酶相比有顯著的提高，連續(xù)反應10次后，固定化酶仍然具有良好的使用性能，此時牛蒡菊糖的提取率為9.42%。

牛蒡；菊糖；中性蛋白酶；殼聚糖；固定化酶

牛蒡，別名樹根菜，又名大力子，是菊科牛蒡?qū)僦备祪赡晟笮筒荼局参?，生長適應性強，在我國江蘇省徐州市的沛縣、豐縣已實現(xiàn)大面積人工栽培[1]。牛蒡根營養(yǎng)十分豐富，含多種維生素和鈣、鎂、銅和錳等礦物質(zhì)，還含有牛蒡甙、牛蒡酚、牛蒡苦素和菊糖等有機物，有健胃、益氣、利尿、瀉下、滋陰壯陽、清熱解毒和抑菌消炎等功效[2]，深受日本及東南亞等國家人們的喜愛。在國內(nèi)，牛蒡根作為民間草藥，藥典并未收載，也很少形成商品。隨著人們對它營養(yǎng)價值的不斷深入了解，牛蒡?qū)⒂袕V闊的發(fā)展前景[3-5]。

菊糖，又稱菊粉，廣泛存在于自然界菊科植物體內(nèi)，在牛蒡中含量極其豐富。菊糖是一種呋喃構(gòu)型的D-果糖經(jīng)β(2-1)糖苷鍵脫水聚合而成的果聚糖的混合物。菊糖微溶于冷水，在熱水中能很快溶解；與碘不呈顯色反應，沒有還原性，有旋光性[6]。菊糖是目前發(fā)現(xiàn)的少有的幾種可溶性膳食纖維之一，是體內(nèi)雙歧桿菌及乳酸菌的增強因子，其熱值低，水溶性極好，且溫度越高溶解性越好。它能夠提高鈣、鋅和鐵等礦物質(zhì)的吸收率；有較好的持水性能；可調(diào)節(jié)血液中的膽固醇，降低血壓及血糖，供糖尿病人食用；因此，菊糖可作為防治腫瘤、冠心病、糖尿病和便秘等保健食品配料和天然藥物。另外菊糖還可以改善食品的組織結(jié)構(gòu)，使其結(jié)構(gòu)緊密，同時可改善食品的味覺及口感?；谄涔π?，在食品工藝中，可以將它廣泛加入食品和飼料中，包括乳制品、糖果、焙烤制品、方便餐、早餐谷物及飲料，營養(yǎng)豐富，極其有利于身體健康。

目前，國內(nèi)外從植物體中提取多糖的方法有[3-8]：熱水提取醇沉法、堿提取法、酸提取法、酶提取法、微波提取法、超聲波提取法、CO2超臨界萃取、超濾法等，而利用固定化酶法提取牛蒡菊糖的研究，目前未見報道。本實驗用固定化酶法提取牛蒡菊糖，旨在為開發(fā)利用這一植物資源提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

牛蒡購自徐州市翟山農(nóng)貿(mào)市場。鮮牛蒡根用自來水洗凈、去皮、切成薄片，干燥至質(zhì)量恒定，粉碎，過40目篩，置于磨口瓶中備用。

胰蛋白酶(3500 U/g)、酸性蛋白酶(10萬U/g)、中性蛋白酶(13萬U/g)、木瓜蛋白酶(80萬U/g)、堿性蛋白酶(30萬U/g)、果膠酶(10萬U/g)、纖維素酶(13萬U/g)天津市諾奧科技發(fā)展有限公司；其他試劑均為分析純；水為蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

7230G型可見分光光度計、FA2104N電子天平 上海精密科學儀器有限公司；PC-1000數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋、GZX-DH-600電熱恒溫干燥箱 上海躍進醫(yī)療器械廠；DZF-6020型真空干燥箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；DL-5低速大容量離心機 上海安亭科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 單酶的確定

設(shè)定在50℃下，固液比為1:15，根據(jù)各種酶的活力不同加入一定量的單酶，pH值根據(jù)加入酶類而定，分別酶解4h，取出冷卻，4000r/min離心10min，取上清液分別稀釋到一定倍數(shù)，于分光光度計上測定吸光度，分別測定總糖和還原糖的含量，從而計算出菊糖提取率，確定最佳單酶。

1.3.2 單酶提取牛蒡菊糖研究

1.3.2.1 溫度對牛蒡菊糖提取率的影響

選取pH7、固液比1:15、加酶量10%、時間5h，分別在30、40、50、60℃和70℃下于振蕩器中水浴，取出冷卻，4000r/min離心10min，取上清液，分別稀釋相應的倍數(shù)，測定總糖和還原糖含量，計算出菊糖提取率，確定最佳溫度。

1.3.2.2pH值對牛蒡菊糖提取率的影響

其他條件不變，在溫度50℃條件，研究pH5、6、7、8和9對菊糖提取率的影響，確定最佳pH值。

1.3.2.3 固液比對牛蒡菊糖提取率的影響

其他條件不變，研究固液比1:5、1:10、1:15、1:20和1:25對菊糖提取率的影響，確定最佳固液比。

1.3.2.4 時間對牛蒡菊糖提取率的影響

其他條件不變，研究水浴3、4、5、6h和7h對菊糖提取率的影響，確定最佳時間。

1.3.2.5 加酶量對牛蒡菊糖提取率的影響

其他條件不變，研究加酶量3、6.5、10、13.5g/100mL和17g/100mL對菊糖提取率的影響，確定最佳加酶量。

1.3.3 單酶提取牛蒡多糖正交試驗

選取4個主要影響因素進行四因素三水平的正交試驗，操作步驟同單因素試驗。

1.3.4 固定化酶的制備

1.3.4.1 制備工藝流程

采用吸附法進行固定化酶制備。

1.3.4.2 凝結(jié)液的選擇

在pH7.5、加酶量7.5mg/mL、殼聚糖質(zhì)量濃度3g/ 100mL、吸附時間6h、60℃條件下對酶進行固定化，通過測定酶活力回收率，對以下不同的凝結(jié)液進行選擇：甲醛(40%):NaOH(2mol/L)=2:3(體積比)、甲醇(100%): NaOH(2mol/L)=1:3(體積比)、乙醇(95%):NaOH(15g/ 100mL)=2:4、乙酸乙酯:NaOH(3g/100mL)=2:3。

1.3.4.3 殼聚糖質(zhì)量濃度的選擇

在pH7.5、加酶量7.5mg/mL、時間6h、60℃的條件下，分別在殼聚糖質(zhì)量濃度為1.5、2.0、2.5、3.0g/100mL和3.5g/100mL對酶進行固定化，通過測定酶活力回收率，對殼聚糖質(zhì)量濃度進行選擇。

1.3.4.4pH值對固定化酶活力回收率的影響

在加酶量7.5mg/mL、時間6h和溫度60℃條件下，選取pH6.5、7.0、7.5、8.0和8.5，研究pH值對固定化酶酶活力回收率的影響。

1.3.4.5 加酶量對固定化酶活力回收率的影響

其他條件不變，在pH7.5條件，選擇加酶量2.5、5.0、7.5、10.0mg/mL和12.5mg/mL(殼聚糖酸性溶液的體積)進行研究。

1.3.4.6 固定化時間對固定化酶活力回收率的影響

在pH7.5、加酶量為7.5mg/mL、溫度60℃條件下，選取固定化時間2、4、6、8h和10h進行研究。

1.3.4.7 固定化溫度對固定化酶活力回收率的影響

在pH7.5、加酶量7.5mg/mL、固定化時間6h條件下，選擇固定化溫度30、40、50、60℃和70℃進行研究。

1.3.4.8 固定化酶制備正交試驗

選取4個影響因素進行四因素三水平正交試驗。1.3.5固定化酶提取牛蒡菊糖試驗

1.3.5.1pH值對固定化酶提取菊糖的影響

按單酶酶解法從牛蒡中提取菊糖的步驟，將單酶替換成固定化酶，在溫度60℃、固液比1:15、固定化酶加酶量6.5mg/100mL、時間5h條件下，選取pH5、6、7、8和9進行研究。

1.3.5.2 固定化酶加酶量對菊糖提取率的影響

其他條件不變，在pH6條件下，選取固定化酶量3、6.5、10、13.5g/100mL和17g/100mL情況下，研究固定化酶加酶量對提取牛蒡菊糖的影響。

1.3.5.3 固液比對菊糖提取率的影響

其他條件不變，研究固液比1:5、1:10、1:15、1:20和1:25對固定化酶提取牛蒡菊糖的影響。

1.3.5.4 酶解時間對菊糖提取率的影響

其他條件不變，研究酶解時間3、4、5、6h和7h對固定化酶提取牛蒡菊糖的影響。

1.3.5.5 酶解溫度對菊糖提取率的影響

其他條件不變，研究酶解溫度30、40、50、60℃和70℃對固定化酶提取牛蒡菊糖的影響。

1.3.5.6 固定化酶提取牛蒡菊糖正交試驗

選取4個影響因素進行四因素三水平的正交試驗。

1.3.6 固定化酶使用穩(wěn)定性實驗

選取固定化酶提取菊糖的最佳方案，用同一批固定化酶對牛蒡進行水解，提取菊糖10次，測定每一次的提取率，對固定化酶的穩(wěn)定性進行研究。

1.3.7 分析方法

1.3.7.1 菊糖含量的測定

總糖的測定：采用苯酚-硫酸法[4-10]，以葡萄糖為標準，以吸光度(y)為縱坐標，糖質(zhì)量濃度(μg/mL)(x)為橫坐標，繪制標準曲線，得線性回歸方程：y=0.0593x＋0.0261，R2=0.9993。計算出總糖的含量。

還原糖的測定：采用3,5-二硝基水楊酸法[3-7]，以葡萄糖為標準，以吸光度(y)為縱坐標，糖質(zhì)量濃度(x)為橫坐標，繪制標準曲線，得線性回歸方程：y=0.0162x-0.0860，R2=0.9995。計算出還原糖的含量。

總糖含量減去還原糖含量即為菊糖的含量。

1.3.7.2 菊糖提取率的測定[3]

1.3.7.3 蛋白質(zhì)含量的測定

采用考馬斯亮藍法[11]，以牛血清白蛋白溶液為標準，以吸光度(y)為縱坐標，牛血清白蛋白溶液濃度(x)為橫坐標，繪制標準曲線，得線性回歸方程：y=0.0062x＋0.0411，R2=0.9992。計算出蛋白質(zhì)的含量。

1.3.7.4 蛋白酶活力測定

一個活力單位(U)是指每1g蛋白酶平均1min釋放酪氨酸的微克數(shù)。

1.3.8 酪氨酸標準曲線的繪制[12]

將 L-酪氨酸用 Tris-HCl 緩沖液配制成不同濃度的溶液，測定它們在 275nm 處的吸光度，以濃度(x)為橫坐標，吸光度(y)為縱坐標作出標準曲線。得線性回歸方程：y = 0.0074x＋0.0396，R2=0.9992。計算酶的活力。

1.3.9 游離酶活力測定[13-14]

在具塞試管中依次加入 1mL酶液(V1)、3mL 酶激活劑，37℃水浴中預熱 10min后，加入 10mL 酪蛋白溶液(已經(jīng)于 37℃水浴中預熱)，搖勻，在 37℃水浴中精確反應 10min，然后加入 10mL三氯醋酸溶液，劇烈搖動后，在 37℃水浴中放置0.5h 后，離心，取上清液在275nm 處測定吸光度。

空白為在加入底物之前加入三氯醋酸終止劑。其余步驟同上。

式中：A為溶液的吸光度；V為測定時溶液的總體積/mL；t為測定所用時間/min；V1為酶液的測定用量/ mL；C為酶液的質(zhì)量濃度/(g/mL)。

1.3.10 固定化酶活力測定[12-15]

在具塞試管中加入適量的固定化酶(g)和3mL酶激活劑，在37℃水浴中預熱10min 后，加入 10mL 酪蛋白溶液(已經(jīng)于37℃水浴中預熱)，搖勻，在37℃水浴中精確反應 10min，然后加入 10mL 三氯醋酸溶液，劇烈搖動后，在 37℃水浴中放置0.5h，離心，取上清液在275nm 處測定吸光度?？瞻祝涸诩尤氲孜镏凹尤肴却姿峤K止劑。其余步驟同上。

式中：P為稀釋倍數(shù)；m為固定化酶測定用量/g。

2 結(jié)果與分析

2.1 游離酶提取牛蒡菊糖試驗

2.1.1 最佳單酶的確定

于七支具塞試管中分別加入1g牛蒡粉，在固液比1:15、酶解時間5h、酶解溫度50℃、加酶量10萬U及pH值為各個酶的最佳pH值條件下，研究不同單酶對牛蒡菊糖的提取率，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同單酶的菊糖提取率Fig.1 Effect of enzyme on the yield of inulin from burdock root

由圖1可見，分別用纖維素酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、果膠酶、酸性蛋白酶和胰蛋白酶這七種酶，從牛蒡中提取菊糖，中性蛋白酶的提取率最高，為11.24%，所以在以下實驗中均采用中性蛋白酶進行研究。

2.1.2 單因素試驗

2.1.2.1pH值對中性蛋白酶提取菊糖的影響

由圖2可知，菊糖提取率隨pH值增大而增大，當pH值為7時，菊糖提取率最大，隨著pH值的繼續(xù)增大，提取率變化不大。所以，中性蛋白酶提取菊糖的最佳pH7，此時菊糖提取率為12.07%。當pH值低于7時，由于未達到該酶的最佳狀態(tài)，因此，菊糖的提取率較低；而當pH值大于7時，菊糖提取率也小于在pH值為7時的菊糖提取率。因此，中性蛋白酶的最佳pH值為7。

圖2 pH值對菊糖提取率的影響Fig.2 Effect of pH value on the yield of inulin from burdock root

2.1.2.2 加酶量對中性蛋白酶提取菊糖的影響

圖3 加酶量對菊糖提取率的影響Fig.3 Effect of enzyme dosage on the yield of inulin from burdock root

由圖3可見，當加酶量10g/100mL時，中性蛋白酶的菊糖提取率最高，為12.10%；加酶量再增加時，提取率不能繼續(xù)提高。所以確定最佳加酶量為10g/ 100mL。當加酶量較低時，菊糖不能充分地釋放出來，因此，菊糖提取率較低；當加酶量達到10g/100mL時，菊糖提取率達到最高。

2.1.2.3 固液比對中性蛋白酶菊糖提取率的影響

圖4 固液比對菊糖提取率的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on the yield of inulin from burdock root

由圖4可知，中性蛋白酶在固液比1:15時對牛蒡的菊糖提取率最高，為12.16%。因此最佳固液比為1:15。因為液體比例過高會導致牛蒡液濃度過低，所提取的菊糖量就會降低，而液體比例過低時，牛蒡液濃度又過高，甚至出現(xiàn)糊狀，樣液不能被充分酶解，菊糖提取率就會比較低。

2.1.2.4 酶解時間對中性蛋白酶菊糖提取率的影響

圖5 酶解時間對菊糖提取率的影響Fig.5 Effect of hydrolysis time on the yield of inulin from burdock root

由圖5可知出，中性蛋白酶提取牛蒡中菊糖的最佳酶解時間為5h，提取率為12.45%，時間大于或小于5h，提取率均呈下降趨勢。因此，中性蛋白酶提取牛蒡中菊糖的最佳時間是5h。當酶的作用時間小于5h時，酶的作用沒有得到充分發(fā)揮，因此菊糖提取率不高；而當酶的作用時間大于5h時，可能酶的活性又會有部分損失，菊糖提取率會有所下降，因此酶的最佳作用溫度是5h。

2.1.2.5 酶解溫度對中性蛋白酶菊糖提取率的影響

圖6 酶解溫度對菊糖提取率的影響Fig.6 Effect of hydrolysis temperature on the yield of inulin from burdock root

由圖6可知，在溫度50℃時，中性蛋白酶菊糖提取率最高，為12.44%。當酶的作用溫度小于50℃時，酶的作用沒有得到充分發(fā)揮，因此菊糖提取率不高；而當酶的作用時間大于50℃時，可能酶的活性又會有部分損失，菊糖提取率會有所下降，因此酶的最佳作用溫度是50℃。

2.1.3 最佳條件的確定

表1 單酶提取試驗因素水平表Table 1 Factors and the levels for orthogonal test

表2 中性蛋白酶提取牛蒡菊糖正交試驗結(jié)果Table 2 Experimental design and results

為了優(yōu)化提取條件，在以上單因素試驗的基礎(chǔ)上，進行了四因素三水平正交試驗，選用因素水平見表1，正交試驗結(jié)果見表2。

由表2可知，通過正交試驗，各個因素對中性蛋白酶提取牛蒡菊糖提取率的影響順序為D＞B＞C＞A，最佳組合為D3B1C2A2，在此條件下的牛蒡菊糖提取率為14.42%；而分析最佳為D3B2C2A2。由于試驗最佳方案和分析最佳方案不一致，因此，通過驗證實驗來確定最佳方案。

表3 不同水平下的單酶提取菊糖效果Table 3 Yield of inulin under different extraction conditions

通過驗證實驗，確定最佳方案為D3B2C2A2，即pH7、溫度50℃、固液比1:15、加酶量13.5g/100mL、時間4h，在此條件下，菊糖提取率為14.57%(表3)。

2.2 固定化酶的制備

2.2.1 凝結(jié)液的選擇

圖7 凝結(jié)液對固定化酶活力的影響Fig.7 Effect of suspension medium on the recovery of immobilized enzyme activity

在pH7.5、加酶量7.5mg/mL、時間6h、溫度60℃的條件下，通過測定固定化酶酶活力回收率，對不同的凝結(jié)液進行了選擇。結(jié)果如圖7所示。

由圖7可以看出，當凝結(jié)液為醛:NaOH=2:3時，固定化效果最好，酶活力回收率為38.25%。所以選擇甲醛(40%):NaOH溶液(2mol/L)=2:3作為凝結(jié)液。

2.2.2 殼聚糖質(zhì)量濃度的選擇

表4 殼聚糖質(zhì)量濃度對殼聚糖微球制備的影響Table 4 Effects of chitosan concentration on the preparation of chitosan microspheres

圖8 殼聚糖質(zhì)量濃度對酶活力回收率的影響Fig.8 Effect of chitosan concentration on the recovery of immobilized enzyme activity

由表4和圖8可以看出，當殼聚糖質(zhì)量濃度為2.5g/ 100mL時，固定化的效果最好，酶活力回收率最高，為38.21%。

2.3 酶固定化影響因素

2.3.1 單因素對固定化酶酶活力回收率的影響

2.3.1.1pH值對固定化酶活力回收率的影響

圖9 pH值對固定化酶活力回收率的影響Fig.9 Effect of pH value on the recovery of immobilized enzyme activity

由圖9可知，在pH值為7.5下固定的固定化酶的效果最好，酶活力回收率為38.67%。每一個固定化酶都有其最佳pH值，低于或高于最佳pH值，都不能使酶的作用充分發(fā)揮，因此，該固定化酶的最佳作用pH值為7.5。

2.3.1.2 加酶量對固定化酶活力回收率的影響

圖10 加酶量對固定化酶活力回收率的影響Fig.10 Effect of enzyme concentration on the recovery of immobilized enzyme activity

從圖10可以看出，殼聚糖溶液中的最佳加酶量7.5mg/mL 時的固定化效果最好，此時酶活力回收率為38.58%。殼聚糖溶液中的加酶量過低，酶的固定化量則較少，殼聚糖沒有充分被利用，因此酶活力回收率就會較低；殼聚糖溶液中的加酶量過高，則會超出殼聚糖的吸附量，有些酶就會損失，也會使酶的回收率較低，因此在加酶量在7.5mg/mL時，殼聚糖的含量與酶的含量最為合適，因此酶活力回收率也最高。

2.3.1.3 固定化時間對固定化酶活力回收率的影響

圖11 固定化時間對固定化酶酶活力回收率的影響Fig.11 Effect of immobilization time on the recovery of immobilized enzyme activity

由圖11可知，當固定化時間為6h，固定化效果達到最好，酶活力回收率為38.95%。固定化時間過短，酶的固定化量則較少，因此酶活力回收率就會較低；固定化時間過長，則會增加實驗時間。因此在固定化時間為6h時，作用時間最為合適。

2.3.1.4 固定化溫度對固定化酶活力回收率的影響

圖12 固定化溫度對固定化酶活力回收率的影響Fig.12 Effect of immobilization temperature on the recovery of immobilized enzyme activity

從圖12可以看出，當60℃時，固定化酶的固定化效果最好，酶活力回收率為39.06%。固定化溫度過低，酶的固定化量則較少，因此酶活力回收率就會較低；固定化溫度過高，則會增加實驗時間，同時也會使酶的活性有所較低。因此在固定化溫度為60℃時，作用時間最為合適。

2.3.2 固定化酶工藝的正交試驗

表5 固定化酶工藝正交試驗因素水平表Table 5 Factors and levels for enzyme immobilization

表6 固定化酶固定化條件正交試驗結(jié)果Table 6 Experimental design and results of the orthogonal test for enzyme immobilization

由表5、6可以看出：最佳酶活力回收率為38.78%，最佳水平組合是A2B2C3D1，根據(jù)表中極差R的分析，各個因素對固定化效果的影響順序為A＞B＞C＞D，并且分析最佳為A2B2C3D2。

表7 不同水平下的固定化酶效果Table 7 Recoveries of immobilized enzyme activity under different conditions

由于試驗最佳和分析最佳得到的最優(yōu)水平組合不一致，因此需要做驗證實驗，結(jié)果見表7。由表7可以看出，分析最佳的結(jié)果為39.13%，其值大于試驗最佳，確定固定化酶的固定化最佳工藝為分析最佳：pH7.5，加酶量7.5mg/mL，固定化時間8h，固定化溫度60℃。

2.3.3 固定化酶提取牛蒡菊糖試驗

2.3.3.1pH值對菊糖提取率的影響

圖13 pH值對菊糖提取率的影響Fig.13 Effect of pH value on the yield of inulin

由圖13可以看出，固定化酶的最佳pH值為6，菊糖提取率為11.72%，而游離酶的最佳pH值為7，菊糖提取率為12.07%。說明游離酶經(jīng)過固定化后，其pH值的穩(wěn)定性增加了。

2.3.3.2 加酶量對菊糖提取率的影響

圖14 固定化酶用量對菊糖提取率的影響Fig.14 Effect of immobilized enzyme dosage on the yield of inulin

從圖14可以看出，固定化酶的最佳加酶量是10g/ 100mL，此時菊糖提取率是11.72%。游離酶的最佳加酶量也為10g/100mL時，菊糖提取率為12.10%。

2.3.3.3 固液比對菊糖提取率的影響

圖15 固液比對菊糖提取率的影響Fig.15 Effect of solid/liquid ratio on the yield of inulin

從圖15可以看出，固定化酶提取菊糖的最佳固液比是1:15，菊糖提取率11.79%，而游離酶的最佳固液比也是1:15，菊糖提取率12.16%。

2.3.3.4 酶解時間對菊糖提取率的影響

圖16 酶解時間對菊糖提取率的影響Fig.16 Effect of enzymatic hydrolysis time on the yield of inulin

由圖16可知，游離酶和固定化酶提取菊糖的最佳時間都是5h，此時，游離酶的提取率是12.45%，而固定化酶的提取率為11.74%。

2.3.3.5 酶解溫度對菊糖提取率的影響

圖17 溫度對菊糖提取率的影響Fig.17 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the yield of inulin

由圖17可知，固定化酶的最佳酶解溫度為60℃，此時的菊糖提取率為11.82%，而游離酶的最佳酶解溫度50℃，此時的菊糖提取率為12.44%。說明游離酶經(jīng)過固定化后，其熱穩(wěn)定性增加了。

2.3.3.6 固定化酶提取菊糖的正交試驗

選取4個影響因素進行四因素三水平的正交試驗。選取因素水平表和正交試驗結(jié)果如表8、9所示。

表8 固定化酶試驗的因素及水平表Table 8 Factors and levels for preparation of inulin by immobilized enzyme hydrolysis

表9 固定化酶提取菊糖工藝條件正交試驗結(jié)果Table 9 Experimental design and results for preparation of inulin by immobilized enzyme hydrolysis

由表9正交試驗表可以看出，試驗得到菊糖提取率最高為12.68%，最佳水平組合是A3D2C3B1，根據(jù)表中極差R的分析，各個因素對固定化效果的影響順序為A＞D＞C＞B，并且分析最佳為A3D2C3B2。

由于試驗最佳和分析最佳得到的最優(yōu)水平組合不一致，因此需要做驗證性實驗，結(jié)果如表10所示。

表10 不同水平下的提取效果Table 10 Yield of inulin under different hydrolysis conditions

通過驗證實驗，確定最佳試驗方案是分析最佳，即加酶量13.5g/100mL、時間5h、溫度60℃和pH7，此時，固定化酶對牛蒡菊糖的提取率為12.89%。

2.3.3.7 固定化酶使用穩(wěn)定性實驗

選取固定化酶提取菊糖的最佳方案，用同一批固定化酶對牛蒡進行水解，提取菊糖10次，測定每一次的提取率，對固定化酶的穩(wěn)定性進行研究。結(jié)果如圖18所示。由圖18可見，固定化酶在使用10次后，對牛蒡中菊糖的提取效率由12.62%降低到9.46%，說明酶在經(jīng)過固定化后性能穩(wěn)定，可重復利用。

圖18 固定化酶的穩(wěn)定性實驗Fig.18 Stability test of immobilized enzyme

3 結(jié) 論

3.1 用7種單酶從牛蒡中提取菊糖，其中中性蛋白酶的菊糖提取率最高，為11.24%。

3.2 采用中性蛋白酶提取牛蒡菊糖，最佳工藝條件為：固液比為1:15，中性蛋白酶加酶量為13.5g/100mL，pH7，在50℃下酶解5h，菊糖提取率可達到14.57%。

3.3 固定化酶工藝：采用吸附工藝固定化中性蛋白酶：以甲醛:NaOH=2:3為凝結(jié)液，殼聚糖質(zhì)量濃度為2.5g/100mL，在pH7.5、60℃、加酶量7.5mg/mL中性蛋白酶的條件下，固定化時間8h，酶活力回收率可達到39.13%。

3.4 固定化酶提取牛蒡菊糖的最佳條件為：固液比1:15，固定化酶用量13.5g/100mL，pH7，在60℃、酶解5h，菊糖提取率達到12.89%。

3.5 固定化酶的穩(wěn)定性：固定化酶pH值穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性與溶液酶相比都有顯著的提高，并且固定化酶具有較好的操作穩(wěn)定性，連續(xù)反應10次后，固定化酶仍然具有良好的使用性能。

3.6 用以上方法制備的固定化酶提取的粗菊糖，菊糖含量為65.48%，蛋白質(zhì)含量為1.63%。

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Enzymatic Extraction of Inulin from Burdock (Arctium lappa L.) Root

CAO Ze-hong，LU Hai-yan， DONG Yu-wei，SHAO Ying，YANG Jin-yu，DIAO Jin-jin (Jiangsu Provincial Research Centre of Food and Biology Process Engineering Technology,
School of Food Biological Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, China)

Inulin was extracted by using enzyme hydrolysis method from burdock (Arctium lappa L.) root. The optimum extraction conditions were as follows: neutral protease content 13.5 g/100 mL, pH 7, solid/liquid ratio 1:15, hydrolysis time 6 h, temperature 50 ℃. The yield of inulin under the optimum conditions was 14.57%. A 2.5 g/100 mL solution of chitosan in 1% aqueous acetic acid was prepared which contained 7.5 mg/mL of neutral protease, and then it was poured, dropwise, into a suspension medium consisting of 40% formaldehyde and 2 mol/L of NaOH at the volume ratio of 2:3 at 60℃ and pH 7.5. The immobilization time was 8 h. And the recovery of enzyme activity was 39.13%. The optimum extraction conditions using immobilized enzyme were as follows: pH 7, solid/liquid ratio 1:15, hydrolysis temperature 60 ℃, immobilized enzyme 13.5 g/100 mL. Under such conditions ,the yield of inulin was 12.89%. After 10 times continuous reaction, the yield of inulin decreased to 9.42%, which indicated that the stability of the immobilized enzyme was significantly improved.

burdock；inulin；neutral protease；chitosan；immobilized enzyme

O629.12

A

1002-6630(2010)24-0037-09

2010-06-19

江蘇省高校自然科學研究計劃項目(07KJD550202)；江蘇省高等學校大學生實踐創(chuàng)新訓練計劃項目(X201003)

曹澤虹(1963—)，女，副教授，本科，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：czh001001@163.com