宋尚新，肖紅梅，高 峰，周光宏*，邱良焱

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 教育部肉品加工與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部農(nóng)畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095)

轉(zhuǎn)基因稻米DNA提取方法的比較研究

宋尚新，肖紅梅，高 峰，周光宏*，邱良焱

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 教育部肉品加工與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部農(nóng)畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095)

目的：建立一種以水稻種子為原料，簡便、快速、有效的基因組DNA提取方法，作為轉(zhuǎn)基因稻米的PCR檢測(cè)基礎(chǔ)。方法：選擇傳統(tǒng)的CTAB 法、改良的堿處理法、高溫水煮法，以轉(zhuǎn)基因糙米、非轉(zhuǎn)基因糙米、轉(zhuǎn)基因精米為材料提取DNA，并對(duì)提取物進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果：改良的堿處理法提取的DNA模板的完整性、純度和PCR反應(yīng)方面與傳統(tǒng)CTAB法相近，且比CTAB法的產(chǎn)率高、耗時(shí)短、成本低。結(jié)論：改良的堿處理法可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的CTAB法用于轉(zhuǎn)基因稻米檢測(cè)中DNA模板的制備。

水稻；DNA提??；改良的堿處理法；轉(zhuǎn)基因檢測(cè)

水稻是我國的主要糧食作物，占我國糧食總產(chǎn)的40%[1]，我國在轉(zhuǎn)基因水稻的培育方面進(jìn)行了大量的探索和研究，已培育出大量抗蟲、抗病、抗除草劑轉(zhuǎn)基因水稻[2-5]，其中一些已通過環(huán)境釋放和生產(chǎn)性試驗(yàn)階段[6]，然而近年國內(nèi)外非法轉(zhuǎn)基因水稻污染事件時(shí)有發(fā)生，因此建立有效的轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)方法迫在眉睫，而DNA提取是進(jìn)行轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的前提。在以往的研究中大多數(shù)學(xué)者以水稻新鮮葉片或發(fā)芽幼苗作為提取DNA的材料[7-11]，研究表明直接利用水稻種子提取DNA是可行的。李穩(wěn)香等[12]采用高溫水煮法提取整粒水稻種子的基因組DNA，用于雜交水稻種子純度的SSR(simple sequence repeat)指紋圖譜標(biāo)記鑒定。李娟等[13]采用改良的CTAB (cetyl triethl ammonium bromide)法提取單粒糙米中DNA，與從嫩葉中提取的DNA相比，其質(zhì)量無明顯差異。本研究以糙米和精米為材料，選擇傳統(tǒng)CTAB法、改良的堿處理法和高溫水解法提取DNA，并對(duì)提取物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳和PCR(polymerase chain reaction)擴(kuò)增比較分析，旨在得到一種可以直接以水稻種子為材料、簡便、快速、有效的基因組DNA提取方法，為后續(xù)研究含轉(zhuǎn)基因稻米的飼料及食品的定性和定量檢測(cè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與分組

轉(zhuǎn)基因水稻：香125S/Bar68-1雜交稻，被轉(zhuǎn)入的外源基因包括CaMV35S(cauliflower mosaic virus 35S)啟動(dòng)子、Bar(bialaphos resistance gene)基因、NOS(nopaline synthase gene)終止子；非轉(zhuǎn)基因水稻：香125S/D68非轉(zhuǎn)基因水稻 中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所。

將水稻種子加工成糙米和精米，并充分研磨成粉狀。設(shè)立3種樣品，分別為轉(zhuǎn)基因糙米、非轉(zhuǎn)基因糙米和轉(zhuǎn)基因精米，每種樣品分別采用3種方法提取DNA，共9個(gè)處理，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取方法

CTAB法：參照GB/T 19495.3—2004《轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)核酸提取純化方法》中的CTAB-1法。

改良的堿處理法：參照朱世楊等[9]方法，有改進(jìn)。稱取20mg樣品置于1.5mL離心管中，加入200μL 0.25mol/L NaOH溶液，水浴95℃ 20s處理；加入150μL 0.25mol/L HCl溶液和150μL 0.5mol/L Tris-HC1(pH=8)，水浴85℃處理3min，8000r/min離心5min，上清液可作PCR模板。

高溫水煮法：參照朱世楊等[9]方法，有改進(jìn)。稱取20mg樣品置于1.5mL離心管中，加入100mmol/L Tris-HCl(pH=8.0)、1mol/L KCl、10mmol/L EDTA各200μL，水浴95℃處理8min，8000r/min離心5min，上清液可作PCR模板。

1.2.2 DNA提取物的檢測(cè)

1.2.2.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

用超純水將3種方法提取的DNA模板稀釋到50ng/μL，吸取5μL DNA與1μL上樣緩沖液混勻，在1.0%的瓊脂糖凝膠上85V電泳20min，在熒光成像儀上觀察和拍照。

1.2.2.2 DNA質(zhì)量濃度和純度的測(cè)定

用Thermo Scientific NANODROP 1000分光光度計(jì)檢測(cè)3種方法提取的DNA模板的質(zhì)量濃度和純度。其中DNA純度決定于A260nm/A280nm的大??；DNA質(zhì)量濃度由DNA模板在260nm的吸光度決定，A260nm=1相當(dāng)于DNA質(zhì)量濃度為50ng/μL[14]。DNA產(chǎn)率的大小按照下式計(jì)算：

1.2.3 PCR擴(kuò)增反應(yīng)

選擇水稻內(nèi)源基因SPS(sucrose phosphate synthase)基因，外源基因CaMV35S啟動(dòng)子和NOS終止子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，各基因的引物序列[15]見表1。

25μL反應(yīng)體系：12.5μL PCR預(yù)混液，10μmol/L的上下游引物各1μL，50ng/μL的模板DNA 2μL，加無菌水補(bǔ)齊至25μL。

表1 引物序列及片段大小Table1 Sequence and fragment length of primers

擴(kuò)增條件：SPS：預(yù)變性94℃ 5min；變性 94℃1min，退火 56℃ 40s，延伸 72℃ 40s，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min。CaMV35S、NOS：預(yù)變性94℃ 5min；變性 94℃ 30s，退火 56℃ 30s，延伸 72℃ 1min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0單因素方差分析和Duncan氏法多重比較進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取物檢測(cè)

2.1.1 DNA提取物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

圖1 DNA提取物瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.1 Agarose gel electrophoresis of DNA extracted by different methods

由圖1可見，高溫處理法中的條帶呈現(xiàn)明顯的彌散形，拖尾現(xiàn)象較嚴(yán)重；CTAB法呈現(xiàn)出清晰整齊的條帶，無拖尾現(xiàn)象；改良的堿處理法條帶清晰整齊，無拖尾現(xiàn)象，與CTAB法相近；3種方法均具有一定程度的RNA污染。

2.1.2 DNA提取物產(chǎn)率和純度檢測(cè)結(jié)果

圖2顯示了3種提取方法的DNA產(chǎn)率。改良的堿處理法和高溫水煮法的DNA產(chǎn)率均極顯著高于CTAB法(P＜0.01)。高溫水煮法用于非轉(zhuǎn)基因糙米和轉(zhuǎn)基因精米的DNA產(chǎn)率極顯著高于改良的堿處理法(P＜0.01)，用

于轉(zhuǎn)基因糙米的產(chǎn)率變化不顯著(P＞0.05)。同時(shí)由表2可知，高溫水煮法得到的DNA的質(zhì)量濃度大于60ng/μL，改良的堿處理法大于50ng/μL，CTAB法大于20ng/μL，均可以作為PCR反應(yīng)的模板。

圖2 不同DNA提取方法的DNA產(chǎn)率比較Fig.2 Comparison on the yield of DNA extracted by different methods

圖3 不同DNA提取方法的A260/A280比較Fig.3 Comparison on A260/A280of DNA extracted by different methods

表2 3種提取方法所得DNA的質(zhì)量濃度、純度及PCR陽性擴(kuò)增結(jié)果Table2 Mass concentration, purity and PCR positive amplification results of DNA extracted by three extraction methods

圖3顯示了3種提取方法的A260nm/A280nm的比值。純DNA 的A260nm/A280nm約為1.8，大于1.8表明有RNA污染，小于1.8表明有蛋白質(zhì)污染[16]。CTAB法的A260nm/A280nm在1.86～2.15之間，極顯著高于改良的堿處理法和高溫水煮法(P＜0.01)。高溫水煮法的A260nm/A280nm在1.70～1.88之間，顯著高于改良的堿處理法(P＜0.05)，改良的堿處理法的A260nm/A280nm在1.48～1.71之間(表2)。

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.4 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification products

由圖4a和圖4b可見，3種方法均能較好的擴(kuò)增出35S啟動(dòng)子和NOS終止子，條帶清晰整齊。由圖4c可見，CTAB法和改良的堿處理法能較好擴(kuò)增SPS基因，高溫水煮法擴(kuò)增結(jié)果較差。由表2中PCR陽性結(jié)果與總數(shù)的比值可知，CTAB法的比值為39/43，即為90.7%；改良的堿處理法的比值為40/46，即為87.0%；高溫水煮法的比值為34/42，即為81.0%。

3 討 論

我國在轉(zhuǎn)基因水稻的培育方面進(jìn)行大量的研究，2009年底我國有2種轉(zhuǎn)基因水稻獲得農(nóng)業(yè)部的安全認(rèn)證，即將進(jìn)入商業(yè)化生產(chǎn)階段[17]，由此轉(zhuǎn)基因水稻的

安全性也越來越受到人們的關(guān)注，且近年國內(nèi)外的非法轉(zhuǎn)基因水稻污染事件時(shí)有發(fā)生，如2006年在香港及廣州市場發(fā)現(xiàn)亨氏嬰兒營養(yǎng)米粉中含有非法轉(zhuǎn)基因水稻成分；廣州百佳超市所售散裝大米被查出含有轉(zhuǎn)基因水稻成分[18]。因此建立食品鏈中轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)方法已經(jīng)成為轉(zhuǎn)基因稻米安全研究的熱點(diǎn)，而提取稻米基因組DNA是轉(zhuǎn)基因稻米基因檢測(cè)的前提，目前常用的植物基因組DNA提取方法有傳統(tǒng)的CTAB法，簡易提取法中的堿處理法、高溫水煮法等。傳統(tǒng)的CTAB法提取的DNA質(zhì)量較高，但具有成本高、毒性大、操作煩瑣耗時(shí)等缺點(diǎn)，而簡易提取法大都速度快、成本低，但是DNA提取物的質(zhì)量較差，保存時(shí)間短，PCR 擴(kuò)增效果差。本研究以傳統(tǒng)CTAB法為對(duì)照，對(duì)以往研究中的堿處理法進(jìn)行改良，以期在保證簡易法經(jīng)濟(jì)、簡單、快捷優(yōu)點(diǎn)的基礎(chǔ)上，提高D NA模板的質(zhì)量。

在轉(zhuǎn)基因食品的生產(chǎn)實(shí)踐及海關(guān)檢驗(yàn)中，往往要求經(jīng)濟(jì)、簡單、快捷的DNA提取方法。本實(shí)驗(yàn)中，CTAB法需要消耗至少160min，高溫水煮法需要13min，而改良的堿處理法最快，只需要9min，且改良的堿處理法需要的試劑少、步驟簡單、實(shí)驗(yàn)條件易實(shí)現(xiàn)。因此改良的堿處理法與傳統(tǒng)CTAB法相比，具有經(jīng)濟(jì)、簡單、快捷等優(yōu)點(diǎn)，更適合在實(shí)際生產(chǎn)和檢驗(yàn)中應(yīng)用。

由于植物細(xì)胞具有細(xì)胞壁，要想得到DNA首先必須裂解細(xì)胞壁，因此細(xì)胞裂解是植物基因組DNA提取最關(guān)鍵的步驟。裂解時(shí)間和裂解溫度是影響裂解效果的重要因素，溫度過高時(shí)間過長會(huì)使DNA降解加劇，從而影響DNA的完整性，時(shí)間過短溫度過低，則裂解不充分，從而降低得率。實(shí)驗(yàn)中高溫水煮法的裂解條件為水浴95℃處理8min，DNA的得率最高，但其瓊脂糖凝膠電泳圖譜呈明顯的彌散形，表明其DNA發(fā)生較大程度的降解，這與Vanni等[19]、Collard等[11]的研究結(jié)果類似。CTAB法裂解條件為水浴65℃處理30min，裂解條件較溫和，且因其步驟繁多，在純化過程中也會(huì)損失掉一部分DNA，因此得率最低，但瓊脂糖凝膠電泳圖譜顯示其DNA較完整。改良的堿處理法的裂解條件為水浴85℃處理3min，與朱世楊等[9]的方法相比，將裂解溫度降低了15℃，其DNA得率雖然低于高溫水煮法，但仍然遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于CTAB法，由瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果可見，其DNA完整性與CTAB法相近，明顯優(yōu)于高溫水煮法。因此改良的堿處理法不但比傳統(tǒng)CTAB法的DNA得率高，且完整性較好。

同時(shí)由瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果可見，3種提取方法得到的DNA模板都含有一定程度的RNA污染，可以通過添加RNA酶去除。本實(shí)驗(yàn)中的CTAB法對(duì)樣品進(jìn)行了一次RNA酶處理，而高溫水煮法和改良的堿處理法沒有進(jìn)行RNA酶處理，因此RNA污染較CTAB法多，但是提取成本和時(shí)間減少了，因此可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需求考慮是否使用RNA酶處理。

不同提取方法得到的DNA模板在相同反應(yīng)條件下同時(shí)擴(kuò)增，其PCR結(jié)果與模板的優(yōu)劣具有直接相關(guān)性。由于SPS基因是轉(zhuǎn)基因水稻檢測(cè)中的內(nèi)標(biāo)基因[20]，而35S啟動(dòng)子和NOS終止子是轉(zhuǎn)基因植物中最常出現(xiàn)的外源基因，本實(shí)驗(yàn)選擇這3種基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果都表明3種方法在200bp以下的片段都能得到很好的擴(kuò)增，但是改良的堿處理法和高溫水煮法的條帶都不如CTAB法的亮，究其原因，可能與不同方法得到的產(chǎn)物的純度不同有關(guān)，由于堿處理法和高溫水煮法的DNA產(chǎn)物沒有經(jīng)過純化，與CTAB法相比，其中可能含有較多的P C R抑制劑，如多糖、蛋白質(zhì)、酚類等。由SPS基因的擴(kuò)增結(jié)果及表2可知，與CTAB法和改良的堿處理法相比，高溫水煮法不能很好的擴(kuò)增大片段的基因，其擴(kuò)增效率為81.0%，進(jìn)一步說明高溫水煮法得到的DNA產(chǎn)物降解較嚴(yán)重。而改良的堿處理法的SPS擴(kuò)增為87.0%與CTAB法的90.7%相差較小。因此改良的堿處理得到的DNA模板能進(jìn)行較好的PCR反應(yīng)。

另外，實(shí)驗(yàn)選擇糙米和精米作為材料，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出兩種材料之間具有一定的差異。由圖2可見，3種提取方法的精米的DNA得率明顯小于糙米，同時(shí)由圖3可見，精米的DNA純度優(yōu)于糙米，分布在1.7～2.0之間，可能因?yàn)榫自谕耆テず?，其基因組DNA含量少于糙米，且雜質(zhì)也減少了，從而使得從精米中提取的DNA得率少于糙米，而純度高于糙米。許文濤等[21]研究表明PCR抑制因子主要存在于米麩中，提取樣品中只要含有米麩，PCR反應(yīng)就被完全抑制，而用精米提取的基因組DNA作為模板時(shí)，則不發(fā)生任何PCR抑制現(xiàn)象。由本實(shí)驗(yàn)中的表2可以看出，來自精米的DNA其PCR陽性結(jié)果與總數(shù)的比值比糙米高，與許文濤等[21]的研究結(jié)果相似。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)對(duì)朱世楊等[9]用于提取水稻葉片DNA的堿處理法進(jìn)行改良，將改良的堿處理法直接應(yīng)用于糙米和精米，以傳統(tǒng)CTAB法為對(duì)照，改良的堿處理法不僅經(jīng)濟(jì)、簡單、快捷，且其DNA模板的完整性、純度、PCR反應(yīng)質(zhì)量得到明顯提高。

4 結(jié) 論

改良的堿處理法提取的DNA模板在完整性、純度和PCR反應(yīng)3個(gè)方面與傳統(tǒng)CTAB法相近，且比CTAB法的產(chǎn)率高、耗時(shí)短、成本低、操作簡單。因此改良的堿處理法可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的CTAB法用于轉(zhuǎn)基因稻米檢測(cè)中DNA模板的制備。

[1]OECD. Consensus document on compositional considerations for new varieties of rice (Oryza sativa): key food and feed nutrients and antinutrients[R]. Paris: OECD, 2004.

[2]曉云, 黃昆侖, 秦偉, 等. 轉(zhuǎn)基因水稻食用安全性評(píng)價(jià)國內(nèi)外概況[J].食品科學(xué), 2008, 29(12): 760-765.

[3]CHEN Hao, LIN Yongjun, ZHANG Qifa. Review and prospect of transgenic rice research[J]. Chinese Science Bulletin, 2009, 54: 4049-4068.

[4]XIAO Guoying, YUAN Longping, SUN S S M. Strategy and utilization of a herbicide resistance gene in two-line hybrid rice[J]. Mol Breeding, 2007, 20: 287-292.

[5]王麗冰, 劉立軍, 顏亨梅. 轉(zhuǎn)Bt抗蟲基因水稻的研究進(jìn)展和生物安全性及其對(duì)策[J]. 生命科學(xué)研究, 2009, 13(2): 182-188.

[6]蔣建科. 轉(zhuǎn)基因水稻能不能放心吃[N]. 人民日?qǐng)?bào), 2009-12-25(5).

[7]IKEDA N, BAUTISTA N S, YAMADA T. Ultra-Simple DNA Extraction method for marker-assisted selection using microsatellite markers in rice[J]. Plant Molecular Biology Reporter, 2001, 19: 27-32.

[8]WU Gang, WU Yuhua, NIE Shujing, et al. Real-time PCR method for detection of the transgenic rice event TT51-1[J]. Food Chemistry, 2010, 119: 417-422.

[9]朱世楊, 羅天寬, 張小玲, 等. 8種水稻基因組DNA提取方法的比較[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009, 37(5): 1929-1931.

[10]趙紅霞, 謝攀, 黃志堅(jiān), 等. 一種改良的水稻總DNA提取方法[J]. 湖北大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2006, 28(4): 389-392.

[11]COLLARD B C Y, DAS A, VIRK P S, et al. Evaluation of quick and dirty DNA extraction methods for marker-assisted selection in rice (Oryza sativa L.)[J]. Plant Breeding, 2007, 126: 47-50.

[12]李穩(wěn)香, 詹慶才. 雜交水稻種子純度SSR指紋圖譜標(biāo)記鑒定技術(shù)研究[J]. 中國種業(yè), 2006(3): 21-22.

[13]李娟, 文建成, 譚學(xué)林. 從水稻單粒糙米中快速制備基因組DNA的方法[J]. 分子植物育種, 2007, 5(5): 735-737.

[14]CHAPELA M J, SOTELO C G, PEREZ-MARTIN R I, et al. Comparison of DNA extraction methods from muscle of canned tuna for species identification[J]. Food Control, 2007, 18: 1211-1215.

[15]王小琦, 張名昌, 任志強(qiáng), 等. 轉(zhuǎn)基因水稻定性 PCR檢測(cè)體系的建立[J]. 中國糧油學(xué)報(bào), 2008, 23(6): 202-205.

[16]SHARMA A D, GILL P K, SINGH P. DNA isolation from dry and fresh samples of polysaccharide-rich plants[J]. Plant Mol Biol Rep, 2002, 20: 415a.

[17]劉志偉, 范敬群. 轉(zhuǎn)基因水稻安全性經(jīng)過多個(gè)角度驗(yàn)證[N]. 科技日?qǐng)?bào), 2010-01-07(1).

[18]孫杰. 亨氏轉(zhuǎn)基因米粉驚現(xiàn)港穗[N]. 華夏時(shí)報(bào), 2006-04-04(B07).

[19]VANNI A, ANFOSSI L, GIOVANNOLI C, et al. Evaluation of purification procedures of DNA from maizemeal samples by exploiting different analytical techniques for the assessment of DNA quality[J]. Ann Chim, 2004, 94: 269-280.

[20]AGRIC J. International collaborative study of the endogenous reference gene, sucrose phosphate synthase(SPS), used for qualitative and quantitative analysis of genetically modified rice[J]. Food Chem, 2009, 57: 3525-3532.

[21]許文濤, 黃昆侖, 鄧愛科, 等. 稻米中PCR抑制因子抑制機(jī)理的研究[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(15): 148-151.

Comparison of DNA Extraction Methods for Transgenic Rice

SONG Shang-xin，XIAO Hong-mei，GAO Feng，ZHOU Guang-hong*，QIU Liang-yan
(Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control, Ministry of Education, Key Laboratory of Agricultural and Animal Products Processing and Quality Control, Ministry of Agriculture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Objective: To establish a simple, fast and effective DNA extraction method from transgenic rice. Methods: DNA extraction methods including traditional CTAB method, improved alkali-treated method and boiling-treated method for DNA extraction from transgenic brown rice, non-transgenic brown rice and transgenic milled rice were compared to screen the optimal extraction method. Results: The integrity, purity and PCR result of template DNA extracted by improved alkali-treated method were similar with the DNA extracted by traditional CTAB method. Meanwhile, compared with traditional CTAB method, improved alkali-treated method had higher DNA extraction rate, less consuming time and lower cost. Conclusion: Improved alkalitreated method can replace traditional CTAB method as DNA extraction method for the detection of transgenic rice.

rice；DNA extraction；improved alkali-treated method；detection of transgene

S511

A

1002-6630(2010)22-0445-05

2010-03-05

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(xiàng)(2009ZX08012-014B)

宋尚新(1987—)，女，碩士研究生，主要從事動(dòng)物營養(yǎng)與畜產(chǎn)品品質(zhì)研究。E-mail：2008105069@njau.edu.cn

*通信作者：周光宏(1960—)，男，教授，博士，主要從事肉品質(zhì)量安全控制研究。E-mail：ghzhou@njau.edu.cn