齊蓮子，遲玉杰*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，大豆生物學(xué)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030)

高速剪切對(duì)大豆分離蛋白限制性酶修飾的影響

齊蓮子，遲玉杰*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，大豆生物學(xué)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030)

研究高速剪切預(yù)處理對(duì)大豆分離蛋白限制性酶修飾制備等電點(diǎn)處高分散性蛋白的影響。以酶修飾產(chǎn)物的水解度、分散性為指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，揭示水解度與分散性的關(guān)系。結(jié)果表明，以常規(guī)酶修飾為對(duì)照，高速剪切處理能有效地促進(jìn)大豆分離蛋白的酶修飾，在0.5～2.0h范圍內(nèi)，隨水解時(shí)間的延長(zhǎng)，水解度逐漸增大，分散性也隨之增加。該處理方式的最適參數(shù)為底物質(zhì)量濃度100g/L、剪切速率6000r/min、剪切時(shí)間4min，該條件下酶修飾物的水解度從1.29%提高到4.16%，等電點(diǎn)處分散性由20.62%提高到46.82%，分別提高了3.22倍和2.27倍(P＜0.05)，并將改性時(shí)間由4.5h縮短至2.0h。

大豆分離蛋白；高速剪切；水解度；分散性

Abstract：The aims of the present study were to determine the effect of high-speed shearing before flavourzyme hydrolysis on the degree of hydrolysis (DH) of soybean protein isolate and to analyze the relationship between the DH and dispersibility of soy protein isolate (SPI) in an aqueous solution at the isoelectric point. The introduction of high-speed shearing effectively propelled the enzymatic modification of SPI with flavourzyme. As the hydrolysis time was prolonged from 0.5 to 2.0 h, both the DH and disperisibility of SPI showed a gradual rise. The optimal shearing treatment conditions were found to be:substrate concentration, 100 g/L; shearing rate, 6000 r/min; and shearing duration, 4 min, and the DH of SPI was increased from 1.92% to 4.16% and the disperisibility at the isoelectric point from 20.62% to 46.82% under these conditions, reaching 3.22- and 2.27-fold increments, respectively, but the time required for the completion of enzymatic modification was shortened from 4.5 to 2.0 h.

Key words：soy protein isolate；high-speed shearing；degree of hydrolysis；dispersibility

大豆分離蛋白(SPI)是植物蛋白中為數(shù)不多可替代牛奶、雞蛋等動(dòng)物蛋白的品種之一，具有分散性、乳化性、凝膠性等多種功能特性，廣泛應(yīng)用于各類食品中[1]。蛋白質(zhì)強(qiáng)化酸性飲料pH值處于4.0～5.0，因風(fēng)味良好和營(yíng)養(yǎng)豐富逐漸被人們所青睞。但SPI在近等電點(diǎn)pH4.5處分散性不佳限制了其應(yīng)用，因此提高SPI在其等電點(diǎn)附近的分散性可拓寬其應(yīng)用范圍。酶修飾SPI是一條制備高分散性、良好懸浮穩(wěn)定性蛋白的途徑。Qi等[1]利用胰蛋白酶對(duì)SPI進(jìn)行酶修飾，但此方法底物濃度較低，產(chǎn)品得率不高，且過(guò)度水解導(dǎo)致苦味產(chǎn)生。Achouri等[2]利用中性蛋白酶修飾SPI，其等點(diǎn)電下pH值為4.5的分散性可達(dá)60%以上，但由于酶的添加量較高，增加了成本。Sara等[3]利用菠蘿蛋白酶水解12h后改善了SPI的分散性，但水解周期過(guò)長(zhǎng)，能耗過(guò)大。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，100g/L含量的SPI溶液經(jīng)加熱會(huì)凝固產(chǎn)生凝膠化現(xiàn)象[4]，高濃度、高黏度底物能夠產(chǎn)生酶抑制作用及失活作用，導(dǎo)致反應(yīng)速率下降[5]。因此，目前針對(duì)高濃度底物、低酶用量進(jìn)行限制性酶修飾的報(bào)道較少。

高速剪切作為SPI酶修飾前的一種預(yù)處理手段。目的在于通過(guò)剪切稀釋作用使高濃度、高黏度的SPI分子體系達(dá)到一定的破碎效果，以利于后期酶修飾，旨在提高水解度(DH)的同時(shí)降低酶用量，對(duì)SPI濃度、高速剪切處理?xiàng)l件進(jìn)行研究，明確最適處理參數(shù)，為獲等電點(diǎn)處高分散性SPI粉的生產(chǎn)提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白(蛋白質(zhì)87.11%，脂肪1.98%，水分5.84%，灰分4.95%) 哈高科大豆食品有限責(zé)任公司；風(fēng)味蛋白酶(Flavourzyme) 丹麥NOVO公司；果糖、水合茚三酮等(均為分析純)。

1.2 儀器與設(shè)備

B-290型噴霧干燥儀 瑞士Buchi公司；LD4-2A離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠；ALC-310.3電子分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；pHS-3C型酸度計(jì) 上海精密儀器有限公司；HYP-Ⅱ型消化爐與凱氏定氮儀上海纖檢儀器有限公司；JJ-2B高速組織搗碎機(jī) 江蘇榮華儀器制造有限公司；H722可見分光光度計(jì) 天津市普瑞斯儀器有限公司；JJ-1精密增力電動(dòng)攪拌器 上海浦東物理光學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 大豆分離蛋白組分含量的測(cè)定

粗蛋白質(zhì)：GB/T 5511—2003；水分：GB/T 5479—85；脂肪：GB/T 5009.6—2003；灰分：GB/T 14770—1993。

1.3.2 蛋白酶活力的測(cè)定

采用福林酚比色法[6]，經(jīng)測(cè)定風(fēng)味蛋白酶活力為5.0×104U/g。

1.3.3 常規(guī)酶修飾

基于風(fēng)味蛋白酶(Flavourzyme)在蛋白水解中的應(yīng)用條件，配制一定質(zhì)量濃度的SPI溶液，置于酶反應(yīng)器中，調(diào)節(jié)溫度50℃、pH7.0，加0.5%(E/S)Flavourzyme進(jìn)行酶修飾。反應(yīng)過(guò)程中保持溫度、pH值恒定。酶修飾時(shí)間設(shè)定為0.5～2.0h，每隔0.5h取樣于90℃、15min鈍化蛋白酶，測(cè)定DH。經(jīng)噴霧干燥得到限制性酶修飾SPI粉，測(cè)定其等電點(diǎn)處分散性。

1.3.4 高速剪切預(yù)處理對(duì)SPI限制性酶修飾的影響。

以水解度為指標(biāo)，將不同濃度的SPI溶液經(jīng)高速剪切預(yù)處理一定時(shí)間，然后進(jìn)行酶修飾，考察SPI濃度、高速剪切速率及時(shí)間等參數(shù)對(duì)酶修飾效果的影響。酶修飾參數(shù)同1.2.3節(jié)。

1.3.4.1 單因素試驗(yàn)

單因素試驗(yàn)的條件定為：固定SPI質(zhì)量濃度120g/L，剪切速率6000r/min，剪切時(shí)間2min。改變其中一個(gè)條件，固定其他條件以分別考察SPI質(zhì)量濃度、剪切速率、剪切時(shí)間對(duì)SPI水解度的影響。各因素水平見表1。

表1 單因素試驗(yàn)參數(shù)Table 1 Factors and levels in single factor design

1.3.4.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)確定各因素的取值水平范圍，再對(duì)SPI質(zhì)量濃度、剪切速率、剪切時(shí)間進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，根據(jù)產(chǎn)物的DH確定最佳輔助處理?xiàng)l件。因素水平編碼表見表2。

表2 正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 2 Factors and levels in orthogonal array design

1.3.5 噴霧干燥條件

進(jìn)風(fēng)溫度170℃，出風(fēng)溫度80～90℃。

1.3.6 分析方法

采用茚三酮法測(cè)定水解度[7]；分散性的測(cè)定[8]：稱取20.00gSPI，倒入300mL蒸餾水，在4000r/min的轉(zhuǎn)速下攪拌10min，取出漿液，調(diào)節(jié)pH4.5，于2700r/min、離心10min，利用凱氏定氮法測(cè)定上清液及樣品中蛋白質(zhì)的含量，重復(fù)3次。分散性(protein dispersibility index，PDI)表達(dá)式如下：

1.3.7 統(tǒng)計(jì)分析

水解度及分散性平行測(cè)定3次，采用SAS 8.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 高速剪切預(yù)處理對(duì)SPI酶修飾效果的影響

2.1.1 SPI質(zhì)量濃度對(duì)酶修飾效果的影響

剪切速率6000r/min，剪切時(shí)間2min時(shí)，SPI底物質(zhì)量濃度60～150g/L范圍內(nèi)水解度的變化趨勢(shì)見圖1。當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度為60g/L時(shí)，水解效果最好，DH值達(dá)(3.78±0.036)%。隨底物質(zhì)量濃度的升高，高速剪切輔助限制性酶修飾產(chǎn)物的DH呈降低趨勢(shì)，但在質(zhì)量濃度為60～100g/L下降程度不明顯，下降幅度僅為0.16%。底物濃度大于100g/L時(shí)，DH顯著降低，SPI質(zhì)量濃度為150g/L時(shí)，DH僅為2.72%。

在實(shí)際生產(chǎn)中為提高產(chǎn)品得率，宜采用較高底物濃度進(jìn)行限制性酶修飾。因此，確定底物濃度為100g/L，此時(shí)DH為(3.62±0.037)%。

圖1 蛋白液質(zhì)量濃度對(duì)限制性酶修飾的影響Fig.1 Effect of SPI concentration on DH

2.1.2 剪切速率對(duì)酶修飾效果的影響

在SPI底物質(zhì)量濃度為100g/L、剪切時(shí)間2min條件下，研究剪切速率對(duì)SPI水解度的影響(圖2)，剪切速率在0～6000r/min內(nèi)，DH隨速率的升高迅速上升。當(dāng)剪切速率為6000r/min時(shí)，水解2.0h時(shí)樣品的DH達(dá)最大(3.60±0.022)%，比常規(guī)酶修飾時(shí)提高了2.79倍。剪切速率繼續(xù)增加，水解度則開始下降。

圖2 剪切速率對(duì)SPI限制性酶解的影響Fig.2 Effect of shearing rate on DH

因?yàn)榻?jīng)過(guò)一定速率的剪切處理，SPI結(jié)構(gòu)較疏松，凝聚的蛋白質(zhì)分子逐漸解締并伸展，使酶作用位點(diǎn)暴露，有利于加速酶和底物結(jié)合[9]，DH增加。高速剪切作用使蛋白質(zhì)大分子聚集體破碎為蛋白分子[10]，同時(shí)增加了原先包埋在分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)的暴露機(jī)會(huì)。但剪切速率過(guò)大，使蛋白質(zhì)聚集體產(chǎn)生不可逆的裂解，破壞程度加大，導(dǎo)致分子表觀直徑減少，酶解反應(yīng)不完全[11]。由此，確定最適剪切速率為6000r/min。

2.1.3 剪切時(shí)間對(duì)酶修飾效果的影響

在SPI底物質(zhì)量濃度為100g/L、剪切速率6000r/min條件下，1～5min剪切時(shí)間范圍內(nèi)SPI水解程度的變化趨勢(shì)見圖3，SPI水解程度在1～4min范圍內(nèi)隨時(shí)間的升高呈上升趨勢(shì)，剪切時(shí)間為3、4 min時(shí)，產(chǎn)物在酶解2.0h時(shí)DH增幅不明顯，分別為(4.08±0.051)%和(4.12±0.043)%，再進(jìn)一步延長(zhǎng)剪切時(shí)間則D H顯著降低。

圖3 剪切時(shí)間對(duì)SPI限制性酶解的影響Fig.3 Effect of shearing duration on DH

隨剪切時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)空間構(gòu)象發(fā)生變化[10]，埋藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部的活性部位暴露出來(lái)，擴(kuò)大了與酶接觸的機(jī)會(huì)；然而，剪切時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)，部分蛋白質(zhì)的活性部位逐漸被破壞，因而酶解物的DH有所下降。綜上所述，確定剪切時(shí)間為3min。

2.2 高速剪切輔助酶修飾優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)，以酶解物DH為指標(biāo)，采用L9(34)正交試驗(yàn)確定最佳輔助處理參數(shù)。正交試驗(yàn)及方差分析結(jié)果見表3、4。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Orthogonal array design matrix and experimental results

表4 正交試驗(yàn)方差分析Table 4 Variance analysis for DH with various shearing conditions

比較本試驗(yàn)中A、B、D三個(gè)因素中極差的大小，可得出B因素為最重要因素，其次為D因素，而A因素為不重要因素。三個(gè)因素的主次關(guān)系是B＞D＞A。按照各因素的最好水平選取B2D3A2，即剪切速率6000r/min、蛋白液質(zhì)量濃度100g/L、剪切時(shí)間4min作為輔助處理的較優(yōu)組合。剪切速率對(duì)結(jié)果影響顯著，而剪切時(shí)間及底物質(zhì)量濃度對(duì)結(jié)果影響不顯著。

由于得到的高速剪切輔助限制性酶修飾較優(yōu)組合參數(shù)在正交試驗(yàn)內(nèi)未出現(xiàn)，因此補(bǔ)作這部分的試驗(yàn)，即按照剪切速率6000r/min、蛋白液質(zhì)量濃度100g/L、剪切時(shí)間4min進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)得結(jié)果：水解度為(4.16±0.082)%，分散性為(46.82±0.68)%。

2.3 水解度對(duì)分散性的影響

分散性與DH呈正相關(guān)[12-13]，據(jù)DH的測(cè)定方法，在波長(zhǎng)570nm處測(cè)定的吸光度越大，則樣品的分散性越強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)探討SPI在等電點(diǎn)處分散性和DH的關(guān)系。

圖4 水解度對(duì)SPI分散性的影響Fig.4 Effect of DH on disperisibility of SPI

由圖4所示，經(jīng)輔助處理限制性酶修飾的SPI分散性與空白對(duì)照相比有顯著提高。在低DH范圍內(nèi)，分散性隨DH的增加明顯上升。因?yàn)榻?jīng)風(fēng)味蛋白酶作用后斷裂成小分子短鏈物質(zhì)，使得氨基和羧基的數(shù)目增多，極性增加，電荷密度增大，分子間相互排斥作用增加，親水性增強(qiáng)[14]，從而提高了分散性。另外，SPI經(jīng)輔助處理后，蛋白質(zhì)分子顆粒的表面電荷分布加強(qiáng)，圍繞著新暴露的極性基團(tuán)的結(jié)合水增多，使親水性增強(qiáng)[15]。DH為4.16%時(shí)，在等電點(diǎn)處，改性后SPI粉的分散性可達(dá)到46.82%，提高了2.27倍。

2.4 高速剪切輔助限制性酶修飾的綜合評(píng)價(jià)

表5 改性前后酶修飾結(jié)果比較Table 5 Comparison between routine and high-speed shearing-assisted enzymatic modification of SPI

由表5可見，與空白對(duì)照相比，采用高速剪切輔助進(jìn)行限制性酶修飾，將改性時(shí)間由原來(lái)的4.5h減少到了2.0h，DH也基本達(dá)到一致，且經(jīng)高速剪切處理輔助限制性酶修飾SPI分散性有所提高。

3 結(jié) 論

3.1 利用高速剪切的剪切稀釋作用使高濃度、高黏度的SPI溶液達(dá)到一定的破碎效果。高速剪切作用對(duì)較低濃度SPI水解程度的提高更為顯著。剪切速率過(guò)大導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)破壞程度加大，增加了反應(yīng)接觸面，使速率有所加快。但考慮到能耗及工藝可行性因素，蛋白質(zhì)分子不可能磨得過(guò)細(xì)，同時(shí)也避免因微生物繁殖而影響產(chǎn)品品質(zhì)。剪切時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，使樣品的機(jī)械能轉(zhuǎn)化為不可逆的熱能導(dǎo)致溫度升高，蛋白過(guò)度變性，形成不溶聚合體也不利于酶修飾的進(jìn)行，都會(huì)造成DH降低。

3.2 在酶修飾參數(shù)為酶添加量0.50%、pH7.0、反應(yīng)溫度50℃、反應(yīng)時(shí)間2.0h條件下，通過(guò)正交試驗(yàn)確定高速剪切輔助高濃度大豆分離蛋白限制性酶修飾提高其水解效果的較優(yōu)組合為剪切速率6000r/min、蛋白液質(zhì)量濃度100g/L、剪切時(shí)間4min，與常規(guī)酶修飾相比，高濃度SPI、短時(shí)間內(nèi)水解度從1.29%提高到4.16%，分散性從20.62%提高到46.82%，分別提高了3.22倍和2.27倍。

3.3 高速剪切作用使蛋白質(zhì)大分子聚集體破碎，即打斷了蛋白分子間的較弱的作用力，使得球狀蛋白質(zhì)內(nèi)部的酶切位點(diǎn)暴露出來(lái)，增加與酶結(jié)合的幾率。因此，通過(guò)剪切稀釋作用(分子在流動(dòng)的方向逐步定向，摩擦阻力下降，使得黏度降低)對(duì)高濃度、高黏度的SPI溶液進(jìn)行酶修飾前預(yù)處理，輔助其進(jìn)行限制性酶修飾，在短時(shí)間內(nèi)提高DH，避免苦味肽的產(chǎn)生，并提高其分散性，具有一定的可行性。

3.4 隨DH的增加，輔助限制性酶修飾SPI粉在其等電點(diǎn)處的分散性得到了顯著的改善，為擴(kuò)大其應(yīng)用范圍提供了條件。高速剪切輔助處理可以加速限制性酶修飾反應(yīng)，縮短反應(yīng)時(shí)間，提高效率。

[1] QI M, KALAPATHY U, HETTIARACHCHY N S, et al. Solubility and emulsifying properties of soy protein isolates modified by pancreatin[J]. Food Science, 1997, 62(6):110-115.

[2] ALLAOUA A, ZHANG W, SHI Y X. Enzymatic hydrolysis of soy protein isolate and effect of succinylation on the functional properties of resulting protein hydrolysates[J]. Food Research International, 1998, 31(9):617-623.

[3] SARA E, MOLINA O, JORGE R W. Hydrolysates of native and modified soy protein isolates:structure characteristics, solubility and foaming properties[J]. Food Research International, 2002, 35(6):511-518.

[4] 遲玉杰, 朱秀清, 李文濱. 大豆蛋白質(zhì)加工新技術(shù)[M]. 北京:科學(xué)出版社, 2007:195.

[5] 劉粼. 大豆分離蛋白酶法有限水解過(guò)程動(dòng)力學(xué)研究[J]. 中國(guó)糧油學(xué)報(bào), 2000, 15(6):11-13.

[6] 鄭鐵松, 龔院生. 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]. 鄭州:河南醫(yī)科大學(xué)出版社, 1996

[7] 趙新淮, 馮志彪. 大豆蛋白水解物水解度測(cè)定研究[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 1995, 26(2):178-181.

[8] MARY A V, BARBARA P K. Protein dispersibility and emulsion characteristics of four soy products[J] . Food Science, 1979, 44(1):93-96.

[9] 華欲飛. 醇法大豆?jié)饪s蛋白的物理改性[D]. 無(wú)錫:無(wú)錫輕工學(xué)院,1993.

[10] 吳海文. 花生濃縮蛋白的制備、凝膠形成機(jī)理及其應(yīng)用研究[D]. 北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2009.

[11] MOLINA E, PAPADOPOULOU A, LEDWARD D A. Emusifying properties of high pressure treated soy protein isolate and 7S and 11S globulins[J]. Food Hydrocolloids, 2001, 15(3):263-269.

[12] LAMSAL B P, JUNG S, JOHNSON L A. Rheological properties of soy protein hydrolysates obtained from limited enzymatic hydrolysis[J].Food Science and Technology, 2007, 40(7):1215-1223.

[13] XIANG Z K, HUI M Z, HAI F Q. Enzymatic preparation and functional properties of wheat gluten hydrolysates[J]. Food Chemistry, 2007, 101:615-620.

[14] MARIANNE H, CAROLINE N, CARSTENS J H. Enzymatic hydrolysis of ovomucin and effect on foaming properties[J]. Food Research International, 2008, 41(5):522-531.

[15] IESEL V P, ANN V L, MARC E H. Combined effect of high pressure and temperature on selected properties of egg white proteins[J]. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 2005, 6(1):11-20.

Effect of High-speed Shearing Pretreatment on Limited Enzymatic Hydrolysis of Soy Protein Isolate

QI Lian-zi，CHI Yu-jie*
(College of Food Science, Northeast Agricultural University, Provincial Key Laboratory of Soybean Biology,Education of Ministry, Harbin 150030, China)

TS253.1

A

1002-6630(2010)22-0011-05

2010-02-11

教育部博士點(diǎn)基金項(xiàng)目(20070224001)；黑龍江省自然科學(xué)重點(diǎn)基金項(xiàng)目(ZD200902)

齊蓮子(1983—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)及農(nóng)產(chǎn)品深加工。E-mail：qilianzi@139.com

*通信作者：遲玉杰(1963—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)及農(nóng)產(chǎn)品深加工。E-mail：yjchi@126.com