李 艷，康俊杰，成曉玲，張?jiān)品?，盧九偉

(1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018； 2.河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050018)

3種釀酒酵母釀造赤霞珠干紅葡萄酒的香氣成分分析

李 艷1,2，康俊杰1，成曉玲1，張?jiān)品?，盧九偉1

(1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018； 2.河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050018)

采用液液萃取結(jié)合氣相色譜儀與質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)技術(shù)，分析研究3種釀酒酵母DHS-1、BM45和安琪葡萄酒酵母對(duì)赤霞珠干紅葡萄酒香氣的影響。結(jié)果表明，這3種酵母發(fā)酵的葡萄酒中主要的香氣成分相同，但含量不同。采用SPSS 16.0的最小顯著性差異分析得出，3種酵母發(fā)酵的葡萄酒中有15種香氣物質(zhì)的相對(duì)含量存在顯著性差異。釀酒酵母對(duì)赤霞珠干紅葡萄酒的香氣特點(diǎn)具有重要影響。

酵母；干紅葡萄酒；香氣；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用

葡萄酒的香氣成分決定著葡萄酒的風(fēng)味特征和典型性[1-2]，對(duì)葡萄酒的風(fēng)格和質(zhì)量起著重要的作用[3]。基本理化指標(biāo)成分相近的葡萄酒，感官質(zhì)量有時(shí)相差很大，主要原因就在于酒中的香氣成分種類和比例不同。葡萄酒中的香氣成分主要是醇、酯、有機(jī)酸、醛、酮以及萜烯類物質(zhì)，它們的種類、含量、比例、感官閾值及其相互作用決定了葡萄酒的感官質(zhì)量、風(fēng)味特點(diǎn)和典型性。

葡萄酒香氣成分的組成和來(lái)源非常復(fù)雜，受多種因素影響，可歸于三大方面：葡萄品種、釀酒酵母菌和橡木桶類型[4]。同品種葡萄釀造的葡萄原酒的香氣成分差異，在釀酒工藝相同的前提下，主要是葡萄來(lái)源和酵母菌系糖苷酶活性的不同而造成[5]。因此，酵母對(duì)葡萄酒香氣成分的形成和含量具有重要影響。國(guó)內(nèi)研究釀酒酵母對(duì)葡萄酒香氣成分影響的報(bào)道較少[6-8]。本研究選擇3種釀酒酵母DHS-1、BM45和安琪葡萄酒酵母發(fā)酵赤霞珠干紅葡萄酒，分析葡萄酒香氣成分的含量和相互關(guān)系，以期鑒定釀酒的性能，并為生產(chǎn)中釀造特色的葡萄酒選擇合適的釀酒酵母提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 酒樣

赤霞珠干紅葡萄酒為本研究室2009年采用昌黎產(chǎn)區(qū)盧龍縣鮑子溝赤霞珠(Cabernet Sauvignon)葡萄釀造的干紅葡萄原酒。葡萄的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)為含糖(葡萄糖計(jì))220g/L、酸度(酒石酸計(jì))8.37g/L、糖酸比為26.3、出汁率60%。

葡萄酒釀造：葡萄經(jīng)除梗破碎的葡萄漿中加入50mg/L SO2和20mg/L EX果膠酶，室溫浸漬36h，分別接入活化后的DHS-1(本研究室篩選的釀酒酵母)、BM45和安琪酵母進(jìn)行酒精發(fā)酵，酵母接種量統(tǒng)一為1×106個(gè)

細(xì)胞/mL，發(fā)酵控溫20～25℃，發(fā)酵8～10d，主發(fā)酵結(jié)束后皮渣浸漬24h即分離得到發(fā)酵原酒，蘋果酸-乳酸發(fā)酵采用控溫啟動(dòng)自然發(fā)酵的方式。發(fā)酵設(shè)備為研究室自制的20、30、50L不銹鋼發(fā)酵罐，每個(gè)樣品3個(gè)規(guī)模各發(fā)2罐。蘋果酸-乳酸發(fā)酵結(jié)束后調(diào)SO2含量50mg/L，滿罐貯存，至2010年5月進(jìn)行理化和香氣成分分析。3種釀酒酵母發(fā)酵的干紅葡萄原酒的理化指標(biāo)數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1 3種釀酒酵母發(fā)酵的赤霞珠干紅葡萄酒的理化指標(biāo)Table1 Characteristics of Cabernet Sauvignon wine fermented with different yeasts

1.1.2 釀酒酵母

DHS-1為本研究室于2008年采摘沙城產(chǎn)區(qū)龍眼葡萄后，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行自然發(fā)酵。自然發(fā)酵后期分離得到的一株酵母菌，對(duì)該菌株進(jìn)行WL培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌落和顯微形態(tài)分類，結(jié)合5.8S rDNA-ITS區(qū)域和26S D1/ D2區(qū)域的RFLP分析的分子鑒定和基因測(cè)序證明是一株釀酒酵母(S.cerevisiae)。

BM45 法國(guó)拉曼集團(tuán)的酵母菌種；安琪葡萄酒酵母 中國(guó)湖北安琪活性干酵母有限公司。

1.2 試劑與儀器

乙醚、正戊烷均為分析純?cè)噭?；高純氮?dú)?純度99.99%) 北京市北溫氣體制造廠。

7820- 5973 GC system氣質(zhì)聯(lián)用儀、HP-Innowax capillary column色譜柱(30m×0.25mm，0.25μm)、10μL進(jìn)樣器 Agilent公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鞏義市英裕裕華儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

參照張明霞等[9]和張曉等[10]的方法，并對(duì)其方法進(jìn)行優(yōu)化。取葡萄酒樣品100mL，加入100mL(乙醚:正戊烷=1:3)，放入萃取漏斗搖勻，靜置分層收集上層有機(jī)相于旋轉(zhuǎn)燒瓶中，重復(fù)操作3次。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在30℃條件下蒸發(fā)濃縮至5mL，并收集于刻度定容管中。用高純氮?dú)獯祾邩悠防^續(xù)濃縮至樣品體積為1mL，用0.45μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，待測(cè)。

1.3.2 GC-MS分析條件

GC條件：升溫程序?yàn)橹鶞?0℃保持5min，以5℃/min升至240℃，保持5min。進(jìn)樣口溫度為250℃；檢測(cè)器為氫火焰離子檢測(cè)器，檢測(cè)器溫度為250℃；載氣為氮?dú)猓髁?mL/min；不分流檢測(cè)；進(jìn)樣量為1μL。

MS條件：EI電離源，電子能量70eV，離子源溫度為200℃，連接桿溫度為220℃。分析結(jié)果運(yùn)用NIST 98 標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)進(jìn)行檢索，僅列出匹配度大于90%的結(jié)果(最大值為100%)，并結(jié)合已有的文獻(xiàn)報(bào)道[11-12]進(jìn)行定性分析。利用面積歸一法計(jì)算已定性的香氣物質(zhì)的相對(duì)含量。1.3.3統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均為3次平行的平均值。數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 16.0分析軟件的ANOVA進(jìn)行顯著性方差分析。應(yīng)用LSD法進(jìn)行多重比較分析，并通過(guò)相關(guān)性矩陣進(jìn)行香氣成分間的相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酵母菌發(fā)酵干紅葡萄酒的香氣成分

應(yīng)用液-液萃取法處理采用同一葡萄品種，在相同工藝條件下釀造，用不同釀酒酵母發(fā)酵的干紅葡萄酒樣品，并進(jìn)行GC-MS的定性和定量分析，總離子圖見(jiàn)圖1。

圖1 3種釀酒酵母發(fā)酵赤霞珠干紅葡萄酒的氣相色譜總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatogram of the dry wines fermented with three species of yeasts

表2 3種釀酒酵母發(fā)酵赤霞珠干紅葡萄酒主要香氣成分及其相對(duì)含量(x±s)Table2 Chemical constituents and relative contents identified in the aroma of Cabernet Sauvignon dry wines fermented with different yeasts (x±s)

不同釀酒酵母發(fā)酵葡萄酒的醇、酯和酸類等香氣成分存在差異。從3款赤霞株干紅葡萄酒樣品中共定性檢出33種香氣成分，包括醇類(10種)、酯類(7種)、酸類(11種)、烷烴類(2種)、酮類(1種)、酰胺類(1種)、含硫化合物(1種)。應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)方法-ANOVA分析中的LSD最小顯著性差異分析法，對(duì)3種酵母釀造產(chǎn)生的香氣物質(zhì)之間相對(duì)含量的差異進(jìn)行分析比較，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2中各香氣物質(zhì)的成分和相對(duì)含量可知，用3種釀酒酵母發(fā)酵的葡萄酒中，主要的香氣成分相同，但含量不同。其中，BM45酵母產(chǎn)生的醇類含量較低，但產(chǎn)酸和酯類優(yōu)于DHS-1和安琪酵母。由最小顯著性差異分析可知，1-丙醇、乙酸異戊酯、異戊醇、乳酸乙酯、異丁酸、乙酸、丙酸、1,3-丁二醇、丁二酸二乙酯、3-(甲硫基-1-丙醇)、2,2-二甲基辛酸、苯甲醇、二十烷、苯乙醇和辛酸這15種香氣成分，在3種酵母發(fā)酵的赤霞珠干紅葡萄酒之間存在顯著性差異，說(shuō)明它們產(chǎn)生這15種香氣成分的能力明顯不同。而2-己酮、辛酸乙酯、丁酸、2,3-丁二醇、4-羥基戊酸、丙二酸二乙酯、十六酸和4-羥基苯乙醇8種香氣成分，3種酵母菌的產(chǎn)生能力相似，無(wú)顯著性差異。2-丁醇、2-乙氧基丁烷、己酸乙酯、己醇、己酸和丁二酸單乙酯這6種香氣物質(zhì)的含量，在BM45和安琪兩種酵母之間的差異不顯著，但與DHS-1酵母之間的差異顯著。表明了DHS-1酵母與BM45和安琪兩種酵母之間生成這6種香氣的能力存在顯著差異。葡萄酒中異丁醇、3-甲基丁酸、苯乙基酰胺這3種香氣成分，在DHS-1和安琪這兩種酵母之間差異不顯著，但與BM45酵母相比差異明顯。再比較DHS-1和BM45兩種酵母之間差異不明顯，而與安琪酵母差異顯著的香氣成分，只檢測(cè)到了3-甲基戊酸。

將表2中的香氣物質(zhì)按大類進(jìn)行歸納，可得到3種酵母菌發(fā)酵干紅葡萄酒香氣成分的特性數(shù)據(jù)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 赤霞珠干紅葡萄酒各類香氣物質(zhì)的種類和含量Fig.2 Aroma components and their relative contents in dry wines of Cabernet Sauvignon

圖2 顯示，DHS-1、BM45和安琪3種酵母發(fā)酵的干紅葡萄酒中，均為醇類物質(zhì)的含量占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，其次是酸類和酯類。3種酒醇類占總香氣物質(zhì)的比例依次為82.5%、73.23%、84.69%。其中，異戊醇、苯乙醇、異丁醇的含量排前3位，2-丁醇最低。異戊醇具有苦杏仁和澀味。異丁醇具有雜醇油的醇香氣味。3種酒的醇類物質(zhì)含量排列順序基本相同，表明3種酒中醇類香氣物質(zhì)構(gòu)成相同，這與以前的文獻(xiàn)研究一致。但2,3-丁二醇的含量低于1-丙醇和異丁醇，與Sangeet等[13]的報(bào)道不同。這恰恰說(shuō)明了釀酒葡萄品種、產(chǎn)地和不同酵母菌種所引起的差異。DHS-1發(fā)酵的葡萄酒，苯乙醇含量高于安琪和BM45酵母發(fā)酵的酒，苯乙醇是由苯丙氨酸代謝產(chǎn)生的，它是葡萄酒中重要的呈香物質(zhì)，與其他成分之間存在增效的效果，具有獨(dú)特的紫羅蘭

香、丁香、茴香和玫瑰香味，賦予葡萄酒濃郁優(yōu)雅的風(fēng)味特征。DHS-1酵母菌雖然產(chǎn)苯乙醇的能力強(qiáng)于安琪和BM45酵母，但總體產(chǎn)醇能力不如安琪酵母。

第二類香氣物質(zhì)是酸類，DHS-1、BM45和安琪3種酵母發(fā)酵的干紅葡萄酒中，酸含量分別達(dá)到了13.26%、19.71%、13.07%。酸類物質(zhì)中含量大的成分依次是乙酸、丙酸和4-羥基戊酸。BM45酵母發(fā)酵的酒中乙酸和丙酸的含量明顯高于另外兩個(gè)酵母菌發(fā)酵的酒。3-甲基丁酸和4-羥基戊酸在以前的參考文獻(xiàn)中未見(jiàn)報(bào)道。長(zhǎng)鏈脂肪酸(十六酸)是弱極性化合物，這些不飽和脂肪酸對(duì)于干紅葡萄酒的味感平衡具有調(diào)節(jié)作用；3-甲基戊酸、己酸、辛酸等低級(jí)脂肪酸都具有明顯的脂肪味，它們對(duì)赤霞珠干紅葡萄酒的整體結(jié)構(gòu)具有重要作用。三種酒中酸類物質(zhì)含量的排列順序各不相同，并且BM45酵母菌發(fā)酵的酒中，酸類物質(zhì)明顯高于其他兩種酵母。

第三類香氣物質(zhì)是酯類，BM45酵母發(fā)酵的酒酯的含量最高，DHS-1酵母次之，安琪酵母最少，所占含量依次為5.24%、3.035%和1.65%。酯類的合成主要是在酵母菌體內(nèi)進(jìn)行，生成的產(chǎn)物再通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入酒體中。酯類生成量及成分因菌株而異。當(dāng)酵母菌細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸過(guò)多時(shí)，會(huì)妨礙體內(nèi)合成的酯類產(chǎn)物透過(guò)細(xì)胞膜，從而使生成的酯類減少，香氣低。一般情況下，酯類的生成量和發(fā)酵強(qiáng)度具有平行關(guān)系，發(fā)酵一旦停止，酒香氣開始減弱。加入泛酸和通入空氣，都可促進(jìn)酯類的生物合成，提高葡萄酒的香氣。BM45尤其在乳酸乙酯和丁二酸二乙酯的含量上表現(xiàn)最為突出。乳酸乙酯具有水果和奶油香氣，丁二酸二乙酯有果香氣味。3種酵母在產(chǎn)乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和丙二酸二乙酯的含量上差異不明顯(除DHS-1酵母產(chǎn)丙二酸二乙酯的含量高于BM45和安琪酵母發(fā)酵的酒外)。酵母不同對(duì)葡萄酒中酯的影響不同。己酸乙酯賦予葡萄酒水果香氣；辛酸乙酯具有令人愉快的花果香氣、杏子香氣；乙酸異戊酯具有強(qiáng)烈的水果香氣，似香蕉味、梨的酸甜味[14]。

烷烴類、酮類、酰胺類和含硫化合物4類物質(zhì)中，所占整體香氣成分的含量都相對(duì)較低。烷烴類主要包括2-乙氧基丁烷和二十烷，其中BM45酵母發(fā)酵的酒中含量最高。酮類物質(zhì)通常具有較強(qiáng)的特殊氣味，低級(jí)飽和酮具有特殊香氣。在三款葡萄酒中只檢測(cè)到了2-己酮，含量差異不明顯，其具有干奶酪味。酰胺類的苯乙基酰胺和含硫化合物中3-(甲硫基-1-丙醇)的含量，3種酒的檢測(cè)值差異不明顯。3-(甲硫基-1-丙醇)是赤霞珠葡萄漿果中的香氣成分，屬于品種香氣范疇，具有生土豆味、蒜味，賦予赤霞珠干紅葡萄酒風(fēng)格迥異的風(fēng)味特征。

2.2 葡萄酒中酸、醇、酯類香氣物質(zhì)之間的相關(guān)性分析

酵母在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)形成酯類，也可以在貯存過(guò)程中由葡萄酒中的有機(jī)酸(乙酸、乳酸等)與高級(jí)醇通過(guò)酯化反應(yīng)產(chǎn)生[15]。酸醇化合形成酯的反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，且酯化與水解存在著動(dòng)態(tài)平衡。所以葡萄酒中的脂肪酸、高級(jí)醇和酯類三者之間存在著相關(guān)性。應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件的相關(guān)性分析，將3種酵母菌發(fā)酵葡萄酒的酸、醇和其相應(yīng)的酯類之間的關(guān)系進(jìn)行相關(guān)性矩陣分析，結(jié)果見(jiàn)表3、4。

表3 丙酸、丁酸及其酯類的相關(guān)性矩陣(X1、…、X9變量的相關(guān)矩陣)Table3 Correlation matrix for propionic ,butyric acid and relative esters (correlation matrix for variables: X1...X9)

由表3可知，葡萄酒中的2,3-丁二醇與異丁酸、1,3-丁二醇的含量呈極顯著的正相關(guān)性；丁二酸二乙酯與異丁酸、1,3-丁二醇、2,3-丁二醇的含量相關(guān)性也呈極顯著正相關(guān)性。1,3-丁二醇與丙酸、異丁酸的含量存在顯著相關(guān)性。丁二酸單乙酯與異丁酸的含量有顯著的負(fù)相關(guān)性。丁二酸二乙酯與丙酸之間也存在著顯著的正相關(guān)性。

表4 己酸、乙酸、辛酸及其酯的相關(guān)性矩陣(X1、…、X9變量的相關(guān)矩陣)Table4 Correlation matrix for hexanoic, acetic, caprylic acid and relative esters (correlation matrix for variables: X1...X9)

由表4可知，葡萄酒中的異戊醇和乙酸的含量呈極顯著正相關(guān)性。辛酸和乙酸的含量呈極顯著正相關(guān)性，

而和異戊醇之間為極顯著負(fù)相關(guān)性。乙酸異戊酯與己酸乙酯、己醇的含量呈極顯著正相關(guān)性。辛酸乙酯與異戊醇、3-甲基戊酸的含量也呈極顯著正相關(guān)性。3-甲基戊酸和乙酸含量之間存在著顯著負(fù)相關(guān)性，而和異戊醇之間為顯著的正相關(guān)性。辛酸和3-甲基戊酸、乙酸異戊酯和己酸的含量之間存在著顯著負(fù)相關(guān)性。己酸異戊酯與己醇之間是顯著的正相關(guān)性，和己酸之間是顯著的負(fù)相關(guān)性。辛酸乙酯和乙酸、辛酸的含量之間是顯著的負(fù)相關(guān)性。

3 結(jié) 論

3.1 采用GC-MS方法檢測(cè)3種釀酒酵母發(fā)酵葡萄酒的香氣成分，通過(guò)對(duì)比分析可知，3種酵母菌發(fā)酵的干紅葡萄酒中產(chǎn)生量最多的是醇類物質(zhì)，酸類次之，酯類第三。但某些微量香氣物質(zhì)有差異，也就賦予了赤霞珠干紅葡萄酒不同的風(fēng)味。本研究結(jié)果為不同類型赤霞珠干紅葡萄酒的釀造提供了有用信息。

3.2 應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)方法-ANOVA分析中的LSD最小顯著性差異分析，對(duì)3種酵母發(fā)酵的干紅葡萄酒中的香氣物質(zhì)之間的差異進(jìn)行了對(duì)比分析。得出3種酵母發(fā)酵的干紅葡萄酒中，大多數(shù)香氣物質(zhì)的含量因酵母菌的不同而存在顯著性的差異。

3.3 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)分析中的相關(guān)性矩陣分析方法，有效地分析了葡萄酒中醇、酸、酯類之間的相關(guān)性。

3.4 通過(guò)研究證明了酵母菌對(duì)葡萄酒風(fēng)味特征影響的重要性和分離篩選產(chǎn)區(qū)，甚至是葡萄園土著酵母的必要性，以及對(duì)釀造特色葡萄酒的重要作用。

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Aroma Components in Cabernet Sauvignon Dry Red Wine Fermented with Three Species of Yeast Strains

LI Yan1,2，KANG Jun-jie1，CHENG Xiao-ling1，ZHANG Yun-feng1，LU Jiu-wei1
(1. College of Bioscience and Bioengineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China；2. R&D Center for Fermentation Engineering of Hebei Province, Shijiazhuang 050018, China)

The aromatic components in Cabernet Sauvignon dry red wine fermented with DHS-1, BM45 and Angel yeast were compared using liquid-liquid extraction method and gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Results showed that the three wines had the same aroma component. However, the relative contents of 15 aroma components had significant difference among the three wins. So S. cerevisiae has an important influence on the aroma characteristics of Cabernet Sauvignon dry wine.

yeast；dry red wine；aroma component；GC-MS

TS262.6

A

1002-6630(2010)22-0378-05

2010-06-27

河北省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(092210003D)

李艷(1958—)，女，教授，本科，主要從事傳統(tǒng)發(fā)酵工程創(chuàng)新技術(shù)研究。E-mail：lymdh5885@163.com