林慧霞，聶少平*，殷軍藝，李 菁，李 昌，謝明勇

(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047)

大粒車(chē)前子多糖提取工藝優(yōu)化及其理化性質(zhì)測(cè)定

林慧霞，聶少平*，殷軍藝，李 菁，李 昌，謝明勇

(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047)

采用水提、醇沉法從大粒車(chē)前子中提取得到多糖提取物，然后經(jīng)Sevag法脫蛋白、SephacrylTMS-400 HR葡聚糖凝膠柱層析分離純化，得到PLCP-1、PLCP-2和PLCP-3三個(gè)組分。應(yīng)用高效凝膠滲透色譜法等方法測(cè)定PLCP-2組分純度及其理化性質(zhì)；進(jìn)一步采用單因素試驗(yàn)結(jié)合二次響應(yīng)面法對(duì)車(chē)前子多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：PLCP-2為均一多糖(PLP)，測(cè)得其相對(duì)分子質(zhì)量為1849268、糖含量87.3%、蛋白含量1.2%、糖醛酸含量14.7%；通過(guò)嶺脊分析獲得最佳提取工藝條件，結(jié)合實(shí)際操作將最佳條件修正為提取溫度99℃、料液比1:30(g/mL)、提取時(shí)間5.45h，實(shí)際測(cè)得多糖得率為13.79%，與理論預(yù)測(cè)值比較接近。該工藝經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)約、可行性強(qiáng)。

車(chē)前子多糖；分離純化；理化性質(zhì)；二次響應(yīng)面法

車(chē)前子為大粒車(chē)前(Plantago asiatica L.)或平車(chē)前(Plantag depressa Willd.)的干燥成熟種子[1]，車(chē)前子被我國(guó)衛(wèi)生部列為可用于保健食品的物質(zhì)，也是我國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)用藥之一。性甘，微寒，歸肝、腎、肺、小經(jīng)，具有清熱利尿、滲濕通淋、明目祛痰的功能[2]。車(chē)前子種皮外表細(xì)胞壁含有的黏液質(zhì)，是一種親水性膠體，也是車(chē)前子中主要的有效成分，常被稱(chēng)為車(chē)前子多糖，據(jù)研究車(chē)前子多糖是一種部分發(fā)酵性膳食纖維，不僅具有整腸通便作用，還有降低血脂、調(diào)節(jié)血糖的功能[3]。

車(chē)前子中多糖主要是極性的大分子，水溶性較好，所以一般采用水提法包括冷水浸提法、溫水浸提法、沸

水浸提法、稀堿提取法等。近年來(lái)，超聲波提取法[3]、超臨界流體萃取法等[4]等也逐漸應(yīng)用到多糖提取工藝中。為了增加多糖得率，有學(xué)者對(duì)原料進(jìn)行碾松外皮或粉碎[5-6]，或以單一或復(fù)合酶、微波、超聲等進(jìn)行輔助提取[3]。車(chē)前子多糖是一種比較特殊的多糖，黏性比較大，這給多糖的分離純化帶來(lái)較大的困難，本實(shí)驗(yàn)室曾采用AKTA系統(tǒng)成功地從大粒車(chē)前子中分離、純化得到均一多糖，并發(fā)現(xiàn)其具有免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性[7]。本研究采用常規(guī)凝膠柱層析進(jìn)行多糖分離純化，以期能獲得不同分離體系下的多糖組分以用于結(jié)構(gòu)和活性研究測(cè)試，對(duì)其提取工藝優(yōu)化作探討，并對(duì)各項(xiàng)理化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，為大粒車(chē)前子多糖的實(shí)際應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大粒車(chē)前子產(chǎn)自江西吉安，自然曬干。

SephacrylTMS-400 HR葡聚糖凝膠填料 Amersham Biosciences公司；D-木糖 上海國(guó)藥試劑公司；考馬斯亮藍(lán)G-250(進(jìn)口分裝) Fluka公司；牛血清蛋白Amersco公司；硫酸、無(wú)水乙醇、氯仿、正丁醇、咔唑等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ALPHA1-2型冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Martin Christ公司；TU-1900型雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；AL 104型電子天平 上海梅特勒-托利多儀器公司；DHL-A型電腦恒流泵 上海青浦滬西儀器廠(chǎng)；TDL-5型離心沉淀機(jī) 上海飛鴿系列離心機(jī)廠(chǎng)；Milli-Q型超純水儀 美國(guó)Millipore公司；高效液相色譜儀 Waters公司；Nicolet FT-IR 5700型傅里葉紅外光譜儀 Thermo Electron公司。

1.3 方法

1.3.1 車(chē)前子精制多糖的制備

稱(chēng)取已過(guò)20目篩的車(chē)前子50g，加80%乙醇400mL浸泡1d，雙層濾布過(guò)濾，濾渣置于50℃烘箱中揮干乙醇。干燥后，加500mL蒸餾水，沸水浴回流提取3h，4800r/min離心分離10min，雙層濾布過(guò)濾，濾渣重復(fù)提取一次，合并濾液，真空濃縮，木瓜蛋白酶酶解2h，再用Sevag法(氯仿-正丁醇體積比為4:1)反復(fù)脫蛋白，然后用流動(dòng)自來(lái)水透析48h，蒸餾水透析24h，透析液真空濃縮后緩慢加入9 5%食用級(jí)乙醇(終體積分?jǐn)?shù)為80%)，于4℃冰箱中醇沉過(guò)夜，4800r/min離心分離10min，濾渣依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚各洗兩次，冷凍干燥得車(chē)前子精制多糖(Plantago asiatica L. crude polysaccharide，PLCP)，備用。

1.3.2 車(chē)前子多糖的純化

采用SephacrylTMS-400 HR(2.4cm×60cm)葡聚糖凝膠柱層析對(duì)PLCP進(jìn)行分離純化，苯酚-硫酸法跟蹤檢測(cè)多糖，繪制洗脫曲線(xiàn)。流動(dòng)相：0.15mol/L NaCl溶液；流速：1.25mL/min，4mL/管。

1.3.3 純度及平均相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定

配制1mg/mL的葡萄糖、Dextran T-10、Dextran T-40、Dextran T-70和藍(lán)色葡聚糖溶液。

色譜條件：色譜柱為UltrahydrogelTMLinear Column (7.8cm×300mm)；流動(dòng)相為超純水，流速為0.6mL/min；檢測(cè)器為示差檢測(cè)器；柱溫為35℃；進(jìn)樣量為20μL。

1.3.4 基本理化性質(zhì)測(cè)定

以一定物質(zhì)的量比的單糖混合溶液為標(biāo)準(zhǔn)，作得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，苯酚-硫酸法測(cè)定總糖含量[8]。以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，作得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，考馬斯亮藍(lán)法[9]測(cè)蛋白含量。以葡萄糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)，作得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，硫酸-咔唑法[10]測(cè)定糖醛酸含量。

1.3.5 紫外-可見(jiàn)光譜分析

采用200～900nm波長(zhǎng)范圍對(duì)樣品進(jìn)行光譜掃描。

1.3.6 車(chē)前子多糖提取工藝優(yōu)化

以80%乙醇浸泡24h后的干燥車(chē)前子為原料，熱水浸提，離心過(guò)濾得到澄清液，測(cè)得粗多糖含量再作多糖提取率換算，以其作為指標(biāo)(車(chē)前子多糖相對(duì)于木糖的換算因子K=1.45，粗多糖得率/%=(提取物多糖質(zhì)量/原料質(zhì)量)×100)，對(duì)影響多糖提取率的3個(gè)主要因素：料液比、提取溫度和提取時(shí)間進(jìn)行單因素分析。然后依據(jù)響應(yīng)面分析軟件SAS 8.0提供的模型設(shè)計(jì)三因素三水平試驗(yàn)，并確定3因素零水平和波動(dòng)區(qū)。設(shè)料液比、提取溫度、提取時(shí)間3因素為自變量，粗多糖得率為響應(yīng)值。響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平取值見(jiàn)表1。

表1 車(chē)前子多糖提取響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平編碼Table1 Factors and levels of orthogonal experiments for optimizing extraction conditions of polysaccharides from the seeds of Plantago asiatica L.

2 結(jié)果與分析

2.1 車(chē)前子多糖純化洗脫曲線(xiàn)

葡聚糖凝膠柱層析是根據(jù)多糖分子的大小和形狀不同進(jìn)行分離。PLCP經(jīng)SephacrylTMS-400 HR柱層析分離后得到PLCP-1、PLCP-2和PLCP-3三個(gè)組分(圖1)；單

批次收集樣品經(jīng)高效凝膠滲透色譜(HPGPC)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PLCP-2為單一對(duì)稱(chēng)峰，富集后檢測(cè)其純度仍然很高，記為PLP。

圖1 PLCP洗脫曲線(xiàn)Fig.1 Elution profile of PLCP on gel permeation chromatography

2.2 純度及平均相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定的重均分子質(zhì)量(Mw)約為1600000D；付志紅等[14]采用Sepharose 6(10mm×300mm)凝膠柱層析純化大粒車(chē)前子多糖得一均一組分，推測(cè)分子質(zhì)量為891000D；本實(shí)驗(yàn)得出的車(chē)前子多糖分子質(zhì)量為1849268D。這說(shuō)明不同的車(chē)前子品種、不同的提取、分離純化的手段得到的車(chē)前子多糖相對(duì)分子質(zhì)量不盡相同。

表2 葡聚糖系列的保留時(shí)間和分配系數(shù)Table2 Retention time (tR) and partition coefficient (Kav) of Dextran series

圖2 PLP的示差色譜圖Fig.2 Differential chromatogram of PLP

2.3 基本理化性質(zhì)測(cè)定

表3 PLP化學(xué)組成分析Table3 Chemical compositions of PLP

取制備好的供試品溶液20μL，按1.3.3節(jié)色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果見(jiàn)圖2。圖2中均為均勻?qū)ΨQ(chēng)單一峰，由此可知經(jīng)葡聚糖凝膠系統(tǒng)純化后所得多糖PLP為均一多糖。

采用UltrahydrogelTMLinear 凝膠柱，以葡聚糖系列(T-10、T-40、T-70和藍(lán)色葡聚糖)為標(biāo)準(zhǔn)，以葡萄糖測(cè)定凝膠柱外水體積，表2中列出了葡聚糖系列在流動(dòng)相為水時(shí)測(cè)得的保留時(shí)間tR和分配系數(shù)Kav。采用分配系數(shù)Kav[Kav=(Ve－V0)/(Vt－V0)，其中V0為藍(lán)色葡聚糖的洗脫體積，Vt為葡萄糖的洗脫體積，Ve為測(cè)定葡聚糖或樣品的體積，洗脫體積為保留時(shí)間與流速的乘積]對(duì)葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)的lgMW值進(jìn)行回歸處理，得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Kav=－0.2426lg Mw+1.6297，R=0.9727。PLP的保留時(shí)間為8.233min(圖2)，從該標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上可求得大粒車(chē)前子多糖PLP平均相對(duì)分子質(zhì)量為1849268。

Tomada等[11]從大粒車(chē)前子中分離的“Plantago mucilage A”，推測(cè)其分子質(zhì)量約1500000D；Al-Assaf等[12]測(cè)得卵葉車(chē)前子殼水提及堿提液分子質(zhì)量為7000000D左右，提取的車(chē)前子膠分子質(zhì)量為1000000～2000000D；王東等[13]采用純化大粒車(chē)前子多糖組分PPA

對(duì)于均一多糖，可以直接以其組成單糖作標(biāo)準(zhǔn)，建立回歸方程。但對(duì)于車(chē)前子多糖由不同殘基組成的雜多糖，不同單糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率不同，所以應(yīng)當(dāng)采用與雜多糖的單糖組成摩爾比相同的混合單糖作標(biāo)準(zhǔn)建立回歸方程，求得其總糖含量[15]。由于車(chē)前子多糖中阿拉伯糖和木糖占絕大多數(shù)，因此本實(shí)驗(yàn)中選用與樣品單糖組成相同的阿拉伯糖和木糖混合溶液作標(biāo)準(zhǔn)求出總糖含量。檢測(cè)結(jié)果表明PLP中的糖含量較高，達(dá)87.3%。考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量很少為1.2%。

以葡萄糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)，硫酸-咔唑法測(cè)糖醛酸含量，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[11,13,16]，大粒車(chē)前子多糖中主要的糖醛酸為葡萄糖醛酸，本實(shí)驗(yàn)采用硫酸-咔唑法以葡萄糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照物測(cè)得車(chē)前子多糖PLP組分中的糖醛酸含量為14.7%。但此法受樣品中的中性單糖的干擾，且不能測(cè)定樣品中糖醛酸的種類(lèi)，因而也存在誤差。本實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果與王東等[13]純化的車(chē)前子多糖PPA中糖醛酸含量11.9%比較接近。

2.4 車(chē)前子多糖提取單因素試驗(yàn)

2.4.1 料液比對(duì)多糖提取率的影響

平行稱(chēng)取5份5g的干燥車(chē)前子，固定其他提取因素，料液比分別取1:10、1:20、1:30、1:40、1:50(g/ mL)，結(jié)果如圖3所示，在設(shè)定范圍多糖得率總體呈上升趨勢(shì)。料液比在1:30～1:50之間，粗多糖得率變化不

明顯。由于料液比過(guò)大會(huì)給后續(xù)操作帶來(lái)不便，最終確定料液比為1:30。

圖3 料液比對(duì)多糖提取率的影響Fig.3 Effect of material-liquid ratio on extraction rate of polysaccharides

2.4.2 溫度對(duì)多糖提取率的影響

圖4 溫度對(duì)多糖提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction rate of polysaccharides

平行稱(chēng)取5份5g干燥車(chē)前子，料液比1:30，提取時(shí)間5h，提取溫度分別為30、50、70、90、100℃。結(jié)果如圖4所示，溫度對(duì)多糖得率影響很大，在50～90℃間多糖得率顯著增大，90℃之后緩慢上升，綜合考慮，提取溫度確定為9 0℃。

2.4.3 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

圖5 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響Fig.5 Effect of extraction time on extraction rate of polysaccharides

平行稱(chēng)取5份5g干燥車(chē)前子，料液比1:30，提取溫度為90℃，設(shè)定提取時(shí)間為1、3、5、7、9h，結(jié)果如圖5所示，提取時(shí)間對(duì)多糖得率影響顯著，從1h到5h多糖得率顯著增大，在5h后，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，多糖得率小幅度下降，但總體趨于穩(wěn)定，因此就單因素而言，提取時(shí)間取5 h為宜。

2.4.4 響應(yīng)面分析

根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理[17]，設(shè)計(jì)了三因素三水平共15個(gè)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，用統(tǒng)計(jì)軟件SAS對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析。

表4 響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果Table4 Results of response surface experiments

以粗多糖提取率作為響應(yīng)值，根據(jù)表4中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，用SAS軟件多元回歸分析，所得分析結(jié)果見(jiàn)表5、6。經(jīng)回歸擬合，得到如下多元二次響應(yīng)面回歸模型：

表5 響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果Table5 Result analysis of response surface experiments

表6是二次響應(yīng)面回歸模型方差分析表。此模型P＜0.0002，響應(yīng)面回歸模型達(dá)到高顯著水平，決定系數(shù)為0.9887，說(shuō)明回歸方程擬合成程度很好。由3個(gè)因素影響的車(chē)前子多糖提取率變異系數(shù)為98.87%。逐項(xiàng)顯著

性檢驗(yàn)結(jié)果表明，方程一次項(xiàng)、二次項(xiàng)影響都是顯著的，交互項(xiàng)作用影響不顯著，各具體實(shí)驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線(xiàn)性關(guān)系。殘差部分均由隨機(jī)誤差引起，不存在模型擬合不足的現(xiàn)象，二次曲面能真實(shí)地?cái)M合響應(yīng)面。

表6 回歸方程方差分析Table6 Variance analysis of the established regression equation

表7 因素方差分析表Table7 Variance analysis of each factor

從表7可以看出，影響車(chē)前子多糖得率各因素按影響大小排序?yàn)樘崛囟龋咎崛r(shí)間＞料液比。其中提取溫度對(duì)車(chē)前子多糖提取率影響達(dá)到了極顯著水平(P＜0.001)，而料液比對(duì)車(chē)前子多糖提取率影響不顯著(P＞0.05)。

圖6 料液比(X1)和提取溫度(X2)與多糖提取率(Y)的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plot for the effect of cross-interaction between material-liquid ratio and extraction temperature on extraction rate of polysaccharides from seeds of Plantago asiatica L.

圖7 料液比(X1)提取時(shí)間(X3)與多糖提取率(Y)的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface plot for the effect of cross-interaction between material-liquid ratio and extraction time on extraction rate of polysaccharides from seeds of Plantago asiatica L.

圖8 提取溫度(X2)和提取時(shí)間(X3)多糖提取率(Y)的響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface plot for the effect of cross-interaction between extraction temperature and extraction time on extraction rate of polysaccharides from seeds of Plantago asiatica L.

從圖6可知，提取溫度要比料液比對(duì)車(chē)前子多糖提取率影響大；從圖7可知，提取時(shí)間要比料液比對(duì)車(chē)前子多糖提取率影響大；從圖8可知，提取溫度要比提取時(shí)間對(duì)車(chē)前子多糖提取率影響大。

表8 嶺脊分析表Table8 Ridge analysis table

表8是嶺脊分析結(jié)果，從表8中可以得出，最大響應(yīng)值時(shí)的編碼半徑為1，此時(shí)提取溫度為98.91℃，料液比為1:30.2，提取時(shí)間為5.45h。

為檢驗(yàn)二次響應(yīng)面法的可靠性，采用上述最優(yōu)提取條件進(jìn)行多糖的浸提實(shí)驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得多糖得率為13.79%，與理論預(yù)測(cè)值比較接近。因此，采用此法得到的提取優(yōu)化條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠，有一定實(shí)用價(jià)值。

3 討 論

本研究采用葡聚糖凝膠常壓柱層析柱法從大粒車(chē)前子精制多糖中分離純化得到均一組分PLP。HPGPC法測(cè)得PLP的相對(duì)分子質(zhì)量為1849268?；纠砘再|(zhì)測(cè)定結(jié)果表明，PLP是含有少量蛋白的酸性多糖，而且糖含

量較高，達(dá)到87.3%。而PLP的結(jié)構(gòu)表征及相應(yīng)構(gòu)效關(guān)系，仍有待于進(jìn)一步研究。結(jié)合單因素試驗(yàn)，采用響應(yīng)面分析、嶺脊分析和RSA法探索車(chē)前子多糖最優(yōu)提取條件：提取溫度98.91℃、料液比1:30.2、提取時(shí)間5.45h、結(jié)合實(shí)際操作，將最佳條件修正為提取溫度99℃、料液比1:30、提取時(shí)間5.45h，實(shí)際測(cè)得多糖得率為13.79%，與理論預(yù)測(cè)值比較接近。

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Extraction Processing and Physico-chemical Properties of Polysaccharides from Seeds of Plantago asiatica L.

LIN Hui-xia，NIE Shao-ping*，YIN Jun-yi，LI Jing，LI Chang，XIE Ming-yong
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Polysaccharides were isolated from seeds of Plantago asiatica L. by water extraction and ethanol precipitation, and then subjected to protein removal by Sevag method and purification using gel permeation chromatography on SephacrylTMS-400HR column. Extraction conditions were optimized by orthogonal design and response surface methodology on the basis of extraction rate of polysaccharides. Three fractions were obtained and named as PLCP-1, PLCP-2 and PLCP-3. Results showed that PLCP-2 (also named as PLP) was a kind of homogeneous polysaccharides with molecular weight of 1849268 Da determined by high performance gel permeation chromatography. The contents of polysaccharides and protein were 87.32% and 1.16%, respectively; while the content of uronic acid was 14.66%. The optimal extraction conditions were extraction temperature of 99℃, material-liquid ratio of 1:30 (g/mL) and extraction time of 5.45 h. Under these optimal extraction conditions, the extraction rate of polysaccharides from Plantago asiatica L. was 13.79%, which was in agreement with the predicted value. This optimal extraction conditions are economic, simple and feasible, and also provide a theoretical reference for industrial preparation of polysaccharides from seeds of Plantago asiatica L..

Plantago asiatica L.；purification；physico-chemical properties；response surface methodology

TQ929.2

A

1002-6630(2010)22-0226-06

2010-06-17

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20802032)；教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專(zhuān)項(xiàng)科研基金項(xiàng)目(200804030001)；江西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2008GZH 0050)；食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室目標(biāo)導(dǎo)向項(xiàng)目(SKLF-MB-200806)

林慧霞(1986—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與食品分析。E-mail：lin1986310@163.com

*通信作者：聶少平(1978—)，男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)與工程、食品營(yíng)養(yǎng)與安全及糖生物學(xué)。E-mail：spnie@ncu.edu.cn