王麗娟，胡志和，周 汛，陳照麗，吳海明

(1.天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134；2.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134)

南美白對(duì)蝦蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物過(guò)敏原消減效果研究

王麗娟1,2，胡志和1,2，周 汛2，陳照麗2，吳海明2

(1.天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134；2.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134)

采用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶分解南美白對(duì)蝦的蛋白質(zhì)，以消減其中的蛋白質(zhì)過(guò)敏原；應(yīng)用全身過(guò)敏反應(yīng)和離體回腸平滑肌過(guò)敏性收縮實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，?duì)該工藝蛋白酶酶解產(chǎn)物的致敏性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，3種蛋白酶的蝦蛋白酶解產(chǎn)物所致的全身過(guò)敏反應(yīng)均明顯減輕(與蝦蛋白組比較，0.01＜P＜0.05或P＜0.01)；同時(shí)，3種酶解產(chǎn)物致敏的離體回腸平滑肌對(duì)蝦蛋白和酶解產(chǎn)物過(guò)敏原攻擊的反應(yīng)也明顯減弱(與蝦蛋白致敏組比較，0.01＜P＜0.05或P＜0.01)。綜合評(píng)價(jià)3種酶解產(chǎn)物的致敏性，認(rèn)為木瓜蛋白酶的酶解工藝較好，過(guò)敏原消減比較理想，食用更安全。

南美白對(duì)蝦；胰蛋白酶；木瓜蛋白酶；菠蘿蛋白酶；過(guò)敏實(shí)驗(yàn)

近年來(lái)，食品安全問(wèn)題已成為人們普遍關(guān)心的問(wèn)題。其中食物過(guò)敏問(wèn)題也越來(lái)越受到人們的重視，它是某些嚴(yán)重過(guò)敏性疾病發(fā)病的誘因[1]。海產(chǎn)品作為人類一種重要的食物性蛋白質(zhì)的來(lái)源，深受人們的喜愛(ài)。然而，蝦與蟹等甲殼類動(dòng)物及其制品又是引起食物過(guò)敏較常見(jiàn)的一類食品，且多數(shù)為終生過(guò)敏[2]。因此，研究蝦過(guò)敏及蝦過(guò)敏原，探索消減蝦過(guò)敏原的工藝技術(shù)，進(jìn)一步為開(kāi)發(fā)低敏及脫敏的蝦類制品奠定基礎(chǔ)。本研究通過(guò)觀察并比較南美蝦蛋白酶解產(chǎn)物的全身性過(guò)敏反應(yīng)及對(duì)豚鼠回腸平滑肌的致敏作用，以評(píng)價(jià)和比較蝦蛋白酶解工藝，尋找削減蝦蛋白過(guò)敏原的工藝技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南美白對(duì)蝦(活) 市售。

卵白蛋白(Ⅱ型) 美國(guó)Sigma公司；南美蝦蛋白、3種蝦蛋白酶解產(chǎn)物 實(shí)驗(yàn)室自制；撲爾敏(批號(hào)0903006)天津力生制藥股份有限公司。

表1 全身過(guò)敏反應(yīng)致敏與激發(fā)方法Table 1 Sensitization and stimulation methods of general allergic reactions

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

英國(guó)種Hartly豚鼠，體質(zhì)量170～250g，雌雄各半，由天津市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)為SCXK津2005-0001。

1.3 儀器與設(shè)備

BL-420F生物信號(hào)采集系統(tǒng) 成都泰盟科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 南美白對(duì)蝦蛋白的制備

將南美白對(duì)蝦去殼去頭去尾去腸線后放在勻漿器中勻漿，然后加入4倍體積的冷丙酮(－20℃預(yù)冷過(guò)夜)，4℃、8000r/min離心15min，收集沉淀物，將沉淀物轉(zhuǎn)移至干凈的濾紙上，分散并讓其在室溫下空氣中風(fēng)干后粉碎，之后用抽提液(1mol/L KCl、0.5mmol/L DTT(1,4-dithiothreitol，pH7.4)按1:10的比例抽提過(guò)夜，再次4℃、8000r/min離心15min，取上清，沉淀用抽提液繼續(xù)抽提4h，離心取上清。透析過(guò)夜，兩次獲得的上清液合并后冷凍干燥，于－20℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 南美蝦蛋白酶解產(chǎn)物的制備

將南美蝦蛋白用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶進(jìn)行分解，其酶解條件為胰蛋白酶：pH8.0，酶與底物比1:100，45℃，底物質(zhì)量濃度3g/100mL；木瓜蛋白酶：pH6.5，酶與底物比1:100，60℃，底物質(zhì)量濃度3g/100mL；菠蘿蛋白酶：pH7.5，酶與底物比1:100，55℃，底物質(zhì)量濃度5g/100mL。在酶解過(guò)程中，注意控制酶解液的pH值，酶解時(shí)間均為3h。酶解結(jié)束后，將酶解液pH值至中性，用80℃滅酶10min，冷凍干燥備用[3-4]。

1.4.3 全身過(guò)敏反應(yīng)

將48只豚鼠隨機(jī)分為8組，每組6只，雌雄各半。在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)1周后進(jìn)行初次致敏，激發(fā)時(shí)靜脈注射不成功者舍棄。各組的致敏與激發(fā)方法見(jiàn)表1。致敏期間每天兩次觀察豚鼠的反應(yīng)，包括一般狀態(tài)、進(jìn)食、有無(wú)過(guò)敏反應(yīng)等。激發(fā)后立即觀察60min內(nèi)動(dòng)物的反應(yīng)，觀察指標(biāo)及過(guò)敏反應(yīng)評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2[5]。

表2 豚鼠過(guò)敏反應(yīng)判定標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Evaluation standards for allergic reactions in guinea pigs

1.4.4 致敏豚鼠離體回腸平滑肌過(guò)敏性收縮實(shí)驗(yàn)

將豚鼠隨機(jī)分為7組，每組4～5只。各組先用卵白蛋白等致敏物質(zhì)進(jìn)行致敏。致敏時(shí)進(jìn)行腹腔注射，每次1.0mL/只，隔日1次，共3次。末次注射后第14天進(jìn)行離體腸平滑肌過(guò)敏原攻擊實(shí)驗(yàn)，取致敏豚鼠，放血處死，取出回腸一段，按離體器官裝置進(jìn)行描記，浴管內(nèi)均加入30mL臺(tái)氏液。待腸收縮曲線基線穩(wěn)定后，進(jìn)行過(guò)敏抗原攻擊，觀察、記錄腸收縮幅度[6]，并比較各組腸收縮變化率。

式中：F1為攻擊后的腸平滑肌收縮力/g；F0為攻擊前的腸平滑肌收縮力/g。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用方差分析和t檢驗(yàn)，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以x±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 全身過(guò)敏反應(yīng)

按照表1的分組和表2的評(píng)判指標(biāo)和評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)卵白蛋白、南美蝦蛋白及其酶解產(chǎn)物各組豚鼠分別進(jìn)行致敏和激發(fā)，在致敏和激發(fā)后密切觀察、記錄，并進(jìn)行評(píng)分。各組動(dòng)物全身過(guò)敏反應(yīng)的結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 動(dòng)物全身過(guò)敏反應(yīng)結(jié)果與評(píng)分Table 3 Results and scores of general allergic reactions in guinea pigs

由表3可以看出，南美蝦蛋白存在有明顯的過(guò)敏反應(yīng)，表現(xiàn)為Ⅰ型速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，嚴(yán)重者出現(xiàn)過(guò)敏性休克而死亡，反應(yīng)與陽(yáng)性對(duì)照品卵白蛋白極其相似。而蝦蛋白酶解產(chǎn)物的過(guò)敏反應(yīng)則明顯減輕，不論用蝦蛋白致敏，還是用各種蝦蛋白酶解產(chǎn)物致敏，再分別用各種蝦蛋白酶解產(chǎn)物激發(fā)后的全身過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生率均明顯降低，過(guò)敏反應(yīng)的表現(xiàn)均明顯減輕。

2.2 致敏豚鼠離體回腸平滑肌過(guò)敏性收縮實(shí)驗(yàn)

將卵白蛋白、南美蝦蛋白以及3種蝦蛋白酶解產(chǎn)物致敏并攻擊后的離體回腸平滑肌收縮活動(dòng)的變化匯總見(jiàn)表4。通過(guò)分析并比較各組腸平滑肌在攻擊前后收縮力的變化，評(píng)價(jià)各酶解產(chǎn)物過(guò)敏原消減的效果。

表4 卵白蛋白、南美蝦蛋白以及3種酶解產(chǎn)物的致敏作用比較Table 4 Comparison of allergic effects of egg-white protein, South American white shrimp protein and its hydrolysates prepared with three proteases

從表4及圖1中可以看出，用各蛋白酶酶解產(chǎn)物致敏后，無(wú)論用蝦蛋白過(guò)敏原攻擊還是用酶解產(chǎn)物進(jìn)行攻擊，腸平滑肌的收縮均較卵白蛋白和蝦蛋白致敏組明顯減弱，而且腸平滑肌對(duì)相同濃度的撲爾敏反應(yīng)也較弱，經(jīng)撲爾敏作用后，致敏的腸平滑肌對(duì)酶解產(chǎn)物的攻擊反應(yīng)也減弱，說(shuō)明各酶解產(chǎn)物的致敏性明顯降低。剪輯腸收縮曲線見(jiàn)圖1。

圖1 致敏回腸平滑肌在過(guò)敏原攻擊前后的收縮曲線Fig.1 Contraction curves of isolated ileum smooth muscle before and after allergic attack

3 討 論

近年來(lái)，國(guó)外有報(bào)道[7]稱過(guò)敏性疾病的發(fā)生呈上升趨勢(shì)，食品過(guò)敏是過(guò)敏性疾病的一種，可能成為某些嚴(yán)重過(guò)敏性疾病的誘因。國(guó)內(nèi)調(diào)查，健康人群自訴有食物過(guò)敏的占5.7%，其中皮膚點(diǎn)刺實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性者占自訴曾患食物過(guò)敏的33.5%，占被調(diào)查人數(shù)的1.9%[8]。與成人相比，兒童食物過(guò)敏的發(fā)生率較高，重慶地區(qū)0～24個(gè)月兒童，家長(zhǎng)自訴有食物過(guò)敏的為13.7%，被確診食物過(guò)敏的占5.7%[9]。在致敏的食物中，蝦及蟹等海鮮類食品過(guò)敏的人較多，食用蝦等海產(chǎn)品過(guò)敏引起過(guò)敏性休克的病例并非罕見(jiàn)[10-11]。食物過(guò)敏是一個(gè)非常復(fù)雜的反應(yīng)過(guò)程，臨床數(shù)據(jù)顯示，90%以上的食物過(guò)敏屬于Ⅰ型(速發(fā)型)變態(tài)反應(yīng)[12]，包括3個(gè)階段，即食物過(guò)敏原的致敏階段、激發(fā)階段和效應(yīng)階段。過(guò)敏體質(zhì)的人群，食入過(guò)敏原可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生IgE抗體[13]；當(dāng)再次接觸該類食物，過(guò)敏原與致敏肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞表面IgE抗體特異性結(jié)合，使之脫顆粒，釋放出組胺、5-羥色胺、白三烯等生物活性物質(zhì)，作用于效應(yīng)組織和器官，引起局部或全身過(guò)敏反應(yīng)[14]。食物過(guò)敏可以累及全身許多臟器，如口腔、消化道、呼吸道、皮膚及心血管等，引起各種臨床表現(xiàn)，如惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉，甚至出現(xiàn)呼吸困難、休克，進(jìn)而危及生命[15]。因此，設(shè)法消除蝦中的過(guò)敏原，讓人們吃的安全十分必要。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[16]，多種蛋白酶能夠?qū)讱ゎ悇?dòng)物過(guò)敏原產(chǎn)生良好的降解作用。

該實(shí)驗(yàn)工藝提取的蝦蛋白過(guò)敏原具有很強(qiáng)的過(guò)敏性，其過(guò)敏反應(yīng)的強(qiáng)度或效價(jià)與卵白蛋白相近，但全身過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生的速度較卵白蛋白稍慢(與卵白蛋白比較，P＞0.05)，證明該工藝提取蝦蛋白過(guò)敏原可行。用該蝦蛋白酶解的各種產(chǎn)物的全身過(guò)敏反應(yīng)及致敏的豚鼠回腸平滑肌收縮實(shí)驗(yàn)中，胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶酶解產(chǎn)物的致敏性均明顯降低，但均未能完全消除。綜合分析全身過(guò)敏反應(yīng)和豚鼠回腸平滑肌收縮實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，認(rèn)為木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物的反應(yīng)發(fā)生率較低，反應(yīng)的表現(xiàn)較輕，食用的安全性較高。下一步研究將放在優(yōu)化消減過(guò)敏原的工藝上，使蝦過(guò)敏原消減效果更加理想。

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Elimination of Allergens in South American Shrimp by Protease Hydrolysis

WANG Li-juan1,2，HU Zhi-he1,2，ZHOU Xun2，CHEN Zhao-li2，WU Hai-ming2
(1. Tianjin Key Laboratory of Food Technology, Tianjin 300134, China；2. College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

In order to eliminate the allergens in South American shrimp, proteases such as trypsin, papain and bromelain were individually used to hydrolyze South American shrimp proteins. General immunity experiments in allergic guinea pigs and allergic contraction experiments of isolated ileum were used to evaluate the allergenicity of hydrolysates. The results showed that hydrolysates from South American shrimp proteins digested by each of the three proteases could result in an obvious attenuation of general allergic reactions (Compared with the group of South American shrimp protein, 0.01＜P＜0.05 or P＜0.01). Meanwhile, a reduced allergic contraction reaction of isolated ileum smooth muscle was observed in hydrolyzed South American shrimp proteins (Compared with the group of South American shrimp protein, 0.01＜P＜0.05 or P＜0.01). Comprehensive evaluation exhibited that papain hydrolysates could provide an excellent elimination effect on allergens and higher food safety.

South American white shrimp；trypsin; papain；bromelain；hypersensitive test

TS201.6；R151.41

A

1002-6630(2010)17-0263-04

2010-04-01

“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃重大項(xiàng)目(2008BAD94B09)

王麗娟(1961—)，女，教授，碩士，主要從事食品毒理學(xué)研究。E-mail：wljuan@tjcu.edu.cn