趙金偉，李范洙，張 先*

(延邊大學農(nóng)學院食品科學系，吉林 龍井 133400)

蘋果梨酚類物質(zhì)抗氧化活性研究

趙金偉，李范洙，張 先*

(延邊大學農(nóng)學院食品科學系，吉林 龍井 133400)

通過對DPPH自由基、羥自由基(·OH)和亞硝酸根離子的清除能力實驗，測定蘋果梨幼果和成熟果果皮中提取的酚類物質(zhì)抗氧化活性。結(jié)果表明：蘋果梨酚類物質(zhì)對DPPH自由基、·OH和亞硝酸根離子均有較好的清除效果，其中幼果中提取的酚類物質(zhì)清除效果要好于成熟果果皮。

蘋果梨；酚類物質(zhì)；抗氧化

蘋果梨為薔薇科(Rosaceae)、蘋果亞科(Pmoaceae)、梨屬(Pyrus L.)植物，延邊州栽培歷史已有近90年，年產(chǎn)量接近6萬t，曾兩度被評為優(yōu)良品種，有“北方梨中之秀”的美譽，是延邊州一大支柱產(chǎn)業(yè)[1]。但是目前延邊地區(qū)蘋果梨生產(chǎn)仍然處于粗放的經(jīng)營模式，田間管理、采后處理環(huán)節(jié)薄弱，導(dǎo)致果品質(zhì)量差等問題。每年產(chǎn)生的殘次果占總產(chǎn)量的1/5左右，利用率低，而且創(chuàng)造的價值也低。再者加工技術(shù)滯后，用于加工的量還不足總產(chǎn)量的10%[2]。因此，解決深加工和資源浪費的問題是當務(wù)之急。

蘋果梨中含有比較豐富的糖、有機酸和鉀、氮、鐵等礦物質(zhì)[3-4]，還含有豐富的酚類物質(zhì)。酚類物質(zhì)因具有抗氧化、清除自由基和抑菌等作用，在食品和醫(yī)藥等方面有著廣泛的應(yīng)用，需求量日益增加，這就需要更多的酚類物質(zhì)提取資源。蘋果梨疏果期疏掉的幼果，被大量丟棄，據(jù)調(diào)查每年丟棄的量約為3000t。而這些幼果中含有豐富的酚類物質(zhì)，此外蘋果梨加工過程中可能產(chǎn)生的果皮等下腳料中也含有豐富的酚類物質(zhì)[5]，這些作為酚類物質(zhì)的提取資源來開發(fā)，應(yīng)該具有很好的前景。本研究以幼果和成熟果的果皮為原料提取酚類物質(zhì)，并對其抗氧化活性進行研究，以期為蘋果梨資源的有效利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

測定試材為2009年延邊華龍集團果樹農(nóng)場試驗基地生產(chǎn)的果實。選用疏果期疏掉的單果質(zhì)量約為6g的幼果和成熟期單果質(zhì)量約105g的梨果皮。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH) 美國Sigma公司；對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、水楊酸等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 東京理化器械株式會社；FJ-200高速分散均質(zhì)機 上海標本模型廠；SupelcleanTMENVITM-18 SPE Tubes 6mL(0.5g) 美國Supelco公司；UV-7504紫外-可見分光光度計 上海欣茂儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酚類物質(zhì)的提取及純化

分別稱取蘋果梨幼果和成熟果果皮40g，加入200mL的80%乙醇，利用均質(zhì)機均質(zhì)，抽濾得到濾液，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至黏稠狀，少量的蒸餾水分次充分洗出提取物，然后利用正己烷萃取分離，除去葉綠素等脂溶性物質(zhì)，剩余水相中的物質(zhì)用蒸餾水定容至25mL后利用固相萃取柱純化以除去糖分等物質(zhì)，固相萃取柱在使用前依次用無水乙醇-70%乙醇-50%乙醇-30%乙醇-蒸餾水潤洗，以激活其活性，將萃取液過柱，蒸餾水充分從萃取柱中洗去糖分等水溶性物質(zhì)，舍去濾液，再用30%、50%和70%乙醇依次洗脫，合并洗脫后的酚類提取液，干燥稱質(zhì)量后備用[6-7]。

1.3.2 蘋果梨酚類物質(zhì)對DPPH自由基的清除率測定

取一定質(zhì)量的提取物利用80%乙醇定容，然后稀釋成不同的濃度，從中取樣液2mL，加入2.0×10-4mol/L DPPH溶液2mL，搖勻，在暗處靜置30min，在波長517nm處測定吸光度[8-9]。以抗壞血酸、熊果苷和綠原酸為對照。按式(1)計算。

式中：A0表示溶劑加DPPH后的吸光度；Aj表示樣液加DPPH 后的吸光度。

1.3.3 蘋果梨酚類物質(zhì)對·OH的清除率測定

取6mmol/L硫酸亞鐵溶液2mL加入不同濃度酚類提取物2mL，然后加入6mmol/L的雙氧水2mL，靜置10min后加入6mmol/L的水楊酸溶液2mL，搖勻靜置30min，在510nm波長處測定吸光度[10]。以抗壞血酸、熊果苷和綠原酸為對照。按式(2)計算。

式中：A1表示某質(zhì)量濃度酚類物質(zhì)反應(yīng)后的吸光度；A2表示不添加水楊酸時酚類物質(zhì)的吸光度；A3表示空白對照的吸光度。

1.3.4 蘋果梨酚類物質(zhì)對亞硝酸根清除率的測定

取一定濃度的樣品溶液2mL，加入20μg/mL的亞硝酸鈉1mL，在37℃恒溫保持30min，取出后加入0.4%對氨基苯磺酸溶液1mL，混勻靜置5min，加入0.2%鹽酸萘乙二胺溶液5mL。加水至10mL靜置15min在538nm波長處測定吸光度，通過標準曲線計算亞硝酸根殘留量[11]。以抗壞血酸、熊果苷和綠原酸為對照。按式(3)計算亞硝酸根清除率。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果梨酚類物質(zhì)純度的測定結(jié)果

從蘋果梨幼果和成熟果果皮中獲得的乙醇提取物，由于含有糖類物質(zhì)，濃縮后呈黏稠狀，將會影響酚類物質(zhì)的作用效果，所以利用固相萃取柱進行了提純，其純度平均值分別達到81.7%和78.2%。

2.2 蘋果梨酚類物質(zhì)對DPPH自由基的清除作用

DPPH自由基在有機溶劑中是一種以氮為中心的很穩(wěn)定的自由基，DPPH本身帶有深紫色，在可見光區(qū)517nm波長處有一吸收高峰[12]。

圖1 不同質(zhì)量濃度試樣對DPPH自由基的清除效果Fig.1 Scavenging effects of the phenolic extracts from young and ripe Pingguoli pear peels on DPPH free radicals

由圖1可以看出，蘋果梨幼果和成熟果果皮中提取的酚類物質(zhì)對DPPH自由基的清除率均隨著其質(zhì)量濃度的升高逐漸增大。幼果中提取的酚類物質(zhì)當質(zhì)量濃度達到40μg/mL時，對DPPH自由基的清除率超過93%，IC50為19μg/mL，稍高于對照抗壞血酸。成熟果果皮中提取的酚類物質(zhì)最高清除率接近90%，IC50為30μg/mL。通過上述對最高清除率和IC50的比較，可以看出成熟果果皮中提取的酚類物質(zhì)對DPPH自由基的清除能力稍低于幼果中提取的酚類物質(zhì)。據(jù)研究，蘋果梨酚類物質(zhì)中含量較多的兩種成分是熊果苷和綠原酸[5]，所以利用熊果苷和綠原酸純品進行了對照實驗，其中熊果苷的IC50為4mg/mL，而綠原酸的IC50為15μg/mL。通過IC50的比較，說明綠原酸的清除能力明顯好于熊果苷，而且其隨濃度的變化，清除率變化趨勢與幼果和成熟果果皮中提取的酚類物質(zhì)基本一致，說明在蘋果梨酚類提取物中，對清除DPPH自由基起主要作用的可能是綠原酸。

2.3 蘋果梨酚類物質(zhì)對·OH的清除作用

圖2 不同質(zhì)量濃度試樣對·OH的清除效果Fig.2 Scavenging effects of the phenolic extracts from young and ripe Pingguoli pear peels on hydroxyl free radicals

從圖2可以看出，蘋果梨酚類物質(zhì)對·OH的清除能力雖然不及對照抗壞血酸，但是有一定的清除作用，最高清除率在60%以上，無論是幼果中還是成熟果果皮中提取的酚類物質(zhì)在400μg/mL時其清除率接近最高峰，這與抗壞血酸相一致。蘋果梨酚類物質(zhì)中主要成分之一的綠原酸對·OH的清除率最高達到80%，而熊果苷對·OH的清除效果不明顯，從而說明蘋果梨酚類物質(zhì)對·OH的清除作用中，主要的作用物質(zhì)也可能是綠原酸。

2.4 蘋果梨酚類物質(zhì)清除亞硝酸根的能力

圖3 不同質(zhì)量濃度試樣對亞硝酸根清除率的影響Fig.3 Scavenging effects of the phenolic extracts from young and ripe Pingguoli pear peels on nitrite

亞硝酸鹽和硝酸鹽在食品工業(yè)中常做為發(fā)色劑，具有一定的抗菌防腐作用，同時一些蔬菜中也含有天然的硝酸鹽，亞硝酸鹽更是廣泛存在于各種腌制類食品中。亞硝酸根易與仲胺類化合物在體內(nèi)形成強致癌物——亞硝胺[10]。

從圖3可以看出，隨著試樣質(zhì)量濃度的升高，對亞硝酸根的清除率也逐漸增加，從幼果中提取的酚類物質(zhì)清除率達到80%，成熟果果皮中提取的酚類物質(zhì)最高清除率為65%，均低于對照抗壞血酸。當蘋果梨酚類物質(zhì)的質(zhì)量濃度達到1500μg/mL時對亞硝酸根的清除率接近最高峰，隨質(zhì)量濃度的變化，清除率的增加趨勢與綠原酸和熊果苷的變化趨勢基本一致。蘋果梨酚類物質(zhì)中主要成分的綠原酸和熊果苷對亞硝酸根的清除作用和抗壞血酸一樣達到90%以上。幼果和成熟果果皮中提取的酚類物質(zhì)IC50分別為760μg/mL和850μg/mL，幼果中提取的酚類物質(zhì)清除能力稍高于成熟果果皮中的酚類物質(zhì)。

3 討論與結(jié)論

對蘋果渣酚類物質(zhì)的抗氧化活性研究結(jié)果表明，蘋果酚類物質(zhì)對DPPH自由基的清除率達80%[13]，李安平等[14]利用星蘋果和曼密蘋果提取抗氧化成分測定對DPPH自由基的清除作用，結(jié)果表明IC50分別為10mg/mL和12mg/mL，可以看出其清除能力明顯低于蘋果梨中提取的酚類物質(zhì)。另外研究表明蘋果酚類物質(zhì)中二聚體原花青素含量較高，所以具有較強清除·OH的活性，清除率可高達91%[15]，明顯高于本實驗中測得的蘋果梨酚類物質(zhì)的清除效果。

本實驗中蘋果梨幼果中提取的酚類物質(zhì)對DPPH自由基、·OH和亞硝酸根的清除率均高于成熟果果皮中提取的酚類物質(zhì)，分析其原因可能是蘋果梨生長過程中不同生長時期、果實的不同部位的酚類物質(zhì)種類和含量比例不同所致。據(jù)研究，整個生長期蘋果梨果皮中熊果苷的含量顯著高于綠原酸，而果肉中熊果苷和綠原酸的含量比例約1:1[5]。因為實驗中使用的幼果是整果，所以從中提取的酚類物質(zhì)中綠原酸所占的比率可能高于從果皮提取的酚類物質(zhì)中的比率，從而導(dǎo)致上述的結(jié)果，對此在今后的研究中需要進一步證明。

本實驗中對蘋果梨酚類提取物的純度進行分析，結(jié)果從幼果中和成熟果果皮中提取的酚類物質(zhì)純度分別為81.7%和78.2%。

蘋果梨幼果和成熟果果皮中提取的酚類物質(zhì)對DPPH自由基、·OH和亞硝酸根的清除率達不到綠原酸和熊果苷的效果，可能是因為受到提取物純度的影響，或者是由于提取的蘋果梨酚類物質(zhì)為多種酚類物質(zhì)的混合物，酚類物質(zhì)間的拮抗作用會影響清除效果[16]，具體原因有待進一步的研究。

蘋果梨幼果和成熟果果皮中提取的酚類物質(zhì)對DPPH自由基、·OH和亞硝酸根具有較好的清除作用。因此，栽培過程中大量丟棄的幼果、加工過程中可能產(chǎn)生的果皮等副產(chǎn)物可作為安全、天然、無毒的酚類物質(zhì)提取資源開發(fā)利用，從而提高蘋果梨的附加值。

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Antioxidant Activity Study of Phenolic Compounds from Pingguoli Pear Peels

ZHAO Jin-wei，LI Fan-zhu，ZHANG Xian*
(Department of Food Science, Agricultural College of Yanbian University, Longjing 133400, China)

An antioxidant activity study of phenolic compounds from young and ripe Pingguoli pear peels was carried out by DPPH free radical, hydroxyl free radical and nitrite scavenging assays. It was found that phenolic compounds from Pingguoli pears had good scavenging effect against all DPPH and hydroxyl free radicals and nitrite and that the phenolic extract from young fruit peels was superior to that from ripe fruit peels.

Pingguoli pear；phenolic compounds；antioxidant activity

R284.1

A

1002-6630(2010)17-0170-03

2010-06-22

留學回國人員科研啟動基金項目(教外司留[2007]1108號)；延邊大學科技發(fā)展計劃項目(延大科合字(2006)第14號)

趙金偉(1983—)，男，碩士研究生，研究方向為食品功能性成分分析。E-mail：jinweifull@yahoo.com.cn

*通信作者：張先(1963—)，女，副教授，博士，研究方向為食品功能性素材開發(fā)與應(yīng)用技術(shù)。E-mail：zhangxian@ybu.edu.cn