楊 煉，劉自琴，劉 蓉，陳海琴，陳 衛(wèi)，張 灝*

(江南大學食品學院，食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122)

抗黃曲霉毒素B1單鏈抗體的表達載體的比較

楊 煉，劉自琴，劉 蓉，陳海琴，陳 衛(wèi)，張 灝*

(江南大學食品學院，食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122)

目的：比較4種不同的pET載體在表達抗黃曲霉毒素B1(AFB1)的單鏈抗體(scFv)克隆的特點，確定用以表達scFv-H4的合適載體。方法：將目的基因H4分別克隆到載體pET20b、pET22b、pET28a和pET32a上，分別轉入大腸桿菌BL21(DE3)或Origami(DE3)中，比較誘導過程中細胞的生長狀況和誘導結束后細胞破碎液中scFv-H4的生物活性以及細胞各部分包涵體。結果：pET20b和pET22b能表達具有生物活性的scFv-H4，這些具有生物活性的蛋白主要存在于周質中；pET28a和pET32a不能表達有生物活性的scFv-H4，而pET32a僅能在細胞質中產生大量的包涵體。結論：pET22b可能是表達AFB1的單鏈抗體較優(yōu)的表達載體。

黃曲霉毒素；單鏈抗體；表達；大腸桿菌；p E T

農產品常常受到產毒素的霉菌污染，真菌毒素是霉菌的次級代謝產物。在這些真菌毒素中，黃曲霉毒素最具有致癌性[1]。除色譜分析法外，免疫學分析方法能高通量、高靈敏、高特異性地分析食品和飼料中的黃曲霉毒素的污染[2]。免疫學方法的建立非常依賴于高親和力、高特異性的抗體。

繼多克隆抗體制備技術和單克隆抗體制備技術之后，重組抗體技術無需免疫動物，能夠低成本地大量制造抗體，而且能很容易地控制抗體的親和力和特異性?，F(xiàn)在有許多重組抗體已經成功的應用在食品科學研究和食品工業(yè)中，比如莠去津[3]、小麥蛋白[4]和核盤菌[5]等的檢測。

在這樣的研究中需要大量制備片段，而抗體片段的表達水平嚴重限制了對抗體片段的研究[6]。為解決表達問題，人們嘗試了多種表達系統(tǒng)來表達抗體片段的基因，比如細菌表達系統(tǒng)[7-9]、酵母表達系統(tǒng)[10-11]、植物表達系統(tǒng)[12-13]、昆蟲和哺乳動物細胞[14]。Miller等[15]比較了釀酒酵母、畢赤酵母和大腸桿菌表達抗體片段的效率和穩(wěn)定性，認為大腸桿菌表達系統(tǒng)能最快速、最穩(wěn)定的表達單鏈抗體，也有利于后續(xù)的純化操作。在前期工作中，從Tomlinson I+J人源單鏈抗體文庫中篩選到了一個高親和力的抗黃曲霉毒素B1的抗體克隆[16]；在

此研究基礎上，擬用大腸桿菌來表達這個克隆?；赥7啟動子的pET表達系統(tǒng)是目前最為常用的表達異源蛋白的大腸桿菌表達系統(tǒng)[17]，而該表達系統(tǒng)有多種載體以適應不同性質蛋白的要求，本實驗擬研究不同的pET載體(pET20b、pET22b、pET28a、 pET32a)表達抗黃曲霉毒素B1的單鏈抗體(scFv-H4)的特點，為scFv-H4的表達選擇合適的載體。

1 材料與方法

1.1 菌種、試劑與培養(yǎng)基

抗黃曲霉毒素B1的單鏈抗體H4(GenBank 登錄號1176324)從Tomlinson I+J單鏈抗體文庫 (Geneservice Ltd.，英國劍橋)篩得[16]。E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)、E.coli Origami(DE3)由Novagen公司(北京)提供。

黃曲霉毒素B1-牛血清白蛋白復合物(AFB1-BSA)、黃曲霉毒素B1(AFB1) Sigma公司(上海)的生化級試劑；蛋白A-辣根過氧化氫酶復合物(protein A-HRP)、鎳離子親和樹脂 GE Healthcare公司(上海)；異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、氨芐青霉素(amp)、卡那霉素 上海生工生物工程技術服務有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物 Oxoids公司(上海)；DNA聚合酶 Promega公司(北京)；限制性內切酶、T4連接酶 NEB公司(北京)；其他試劑均為分析純。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、10g NaCl溶于1000mL去離子水；LB平板培養(yǎng)基：瓊脂粉10g、胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、10g NaCl溶于1000mL去離子水。

1.2 儀器與設備

2MK4洗板機和Multiscan MK3酶標儀 熱電(上海)有限公司；UV2100型紫外-可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司；PowerPac型電泳儀和GelDoc XR型凝膠成像系統(tǒng) 伯樂生命醫(yī)學產品(南京)有限公司：Sonics超聲波破碎儀 Vibracell公司。

1.3 scFv-H4基因的克隆

將含有H4基因的pIT2噬菌粒通過聚合酶鏈式反應(PCR)獲得H4基因，引物為：CAG GAA ACA GCT ATG AC和 CTA TGC GGC CCC ATT CA。用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳純化和膠回收后，在37℃，用限制性內切酶NcoI和NotI雙酶切H4基因與載體pET。再經1.0%瓊脂糖凝膠電泳純化和膠回收后，用T4連接酶將內切酶酶切后的目的基因和載體在16℃連接24h。

取連接產物10μL，熱激轉入感受態(tài)的E.coli DH5α，將該E.coli DH5α涂布于LB平板培養(yǎng)基(含amp)。20h后，挑取單克隆用LB培養(yǎng)基(含amp)培養(yǎng)，提取質粒后，用限制性內切酶NcoI和NotI酶切驗證，另測序(上海生工生物工程技術服務有限公司)驗證。然后將成功構建的pET/4H轉入感受態(tài)的E.coli BL21(DE3)或E.coli Origmi (DE3)中，在含有amp抗性的LB平板培養(yǎng)基上涂布培養(yǎng)，挑取單克隆，并用LB培養(yǎng)基(含amp)培養(yǎng)過夜，提取質粒后NcoI和NotI雙酶切驗證，將甘油加入剩余的菌液中至終體積分數(shù)為8%，分裝于－20℃凍存。

1.4 大腸桿菌的培養(yǎng)與scFv-H4的誘導表達

將凍存的菌株接入5mL LB培養(yǎng)基(含amp)中，37℃、200r/min振搖活化至培養(yǎng)物在波長600nm處光密度值(OD600nm)為0.5左右。取活化后的菌液2mL加入100mL LB培養(yǎng)基(含amp)中、37℃、200r/min振搖培養(yǎng)至OD600nm為0.6～0.8后，加入誘導物IPTG(終濃度為1mmol/L)，再在20℃繼續(xù)誘導20h。在E.coli Origami(DE3)的培養(yǎng)和誘導過程中，培養(yǎng)基中加入50μg/mL的卡那霉素維持菌體的突變型。取培養(yǎng)液1mL用水稀釋10倍，測OD600nm值，菌體生物量以OD600nm值表示。

1.5 各部分蛋白的提取

取1.4節(jié)獲得的發(fā)酵物1mL，在11600×g離心15min，所得菌體沉淀用100μL，2×上樣緩沖液溶解，用以分析全細胞蛋白。

培養(yǎng)基上清液：取40mL培養(yǎng)物，14000×g離心，富集菌體；上清液用三氯乙酸濃縮10倍后用于電泳分析。

細胞周質組分：將富集的菌體重懸于1 0 m L 20g/100mL的蔗糖溶液(pH8.0，30mmol/L的Tris-HCl緩沖液)中，加入20μL 0.5mol/L E DTA，室溫緩慢振蕩10min，10000×g 4℃離心收集細胞，棄上清液。將處理后的細胞重懸于10mL冰凍的5mmol/L MgSO4溶液，在冰上緩慢振蕩10min，此時細胞周質蛋白被釋放到緩沖液中。4℃、11600×g離心收集細胞，上清液用三氯乙酸濃縮10倍后用于電泳分析。

細胞質可溶組分：提取細胞周質蛋白后的細胞沉淀用10mL PB S重懸，冰浴上超聲(200W，1s工作，9s間歇)1h后，4℃、10000×g離心，上清液用于電泳分析。

取超聲破碎液1mL于一個干凈的EP管中，11600×g離心15min后，用1mL含2g/100mL曲拉通的PBS洗滌，沉淀3次，再11600×g離心15min，沉淀用100μL 2×上樣緩沖液溶解，用以分析包涵體。

1.6 scFv-H4的純化

取誘導結束后的發(fā)酵物100mL，3300×g離心15min后收集菌體沉淀，用10mL的PBS重懸菌體。重懸的菌體用超聲波破碎儀在200W(1s工作，9s間歇)超聲60個循環(huán)，將超聲破碎液11600×g離心15min。

菌體破碎液離心后的上清液加入螯合有NiSO4的Sepharose Fast Flow凝膠上，用50mmol/L的咪唑溶液(含0.5mol/L NaCl，pH7.7)洗去雜蛋白后，用10mL

200mmol/L的咪唑溶液(含0.5mol/L NaCl，pH7.7)將目標蛋白洗脫。取50μL洗脫液與50μL 2×上樣緩沖液混合，以分析蛋白純度。

1.7 SDS-PAGE凝膠電泳

取5μL樣品(按1.5節(jié)制備)在12%的聚丙烯酰胺凝膠上電泳，80V濃縮25min，再150V分離60～80min。用考馬斯亮藍染色和醋酸-乙醇溶液脫色，在凝膠成像系統(tǒng)上分析蛋白分布與質量濃度。

1.8 ELISA檢測

25μL、0.33μg/mL的AFB1-BSA平鋪于酶標板孔底(Costar 25 92)，在37℃包被2h，用PBS洗滌兩次后，用2g/100mL的BSA溶液封閉酶標板，37℃溫浴2h，再用PBS洗滌兩次。將待測樣液50μL與100μL 2g/100mL BSA溶液一起加入酶標板，37℃溫浴1h，用含有0.1 g/100mL 吐溫-20的PBS(PBST)洗板5次，加入含蛋白A-HRP(體積分數(shù)0.02%)2g/100mL的BSA 溶液100μL，再在37℃溫浴1h，用PBST洗板5次。加入含H2O2(體積分數(shù)0.006%)和TMB(100μg/mL)的醋酸鈉緩沖溶液(pH5.5)100μL，室溫下反應15min后，用50μL、1mol/L的H2SO4終止反應，在酶標儀上讀取OD450nm值和OD650nm值，ELISA的信號值為OD450nm－OD650nm。

在競爭ELISA檢測中，50μL純化后的抗體，100μL 2g/100mL的BSA和不同質量濃度(0～2ng/mL)的黃曲霉毒素B1混合，37℃溫浴1h，取100μL混合液加入上述包被并封閉好的96孔板，ELISA剩余過程如上所述。

2 結果與分析

2.1 目標蛋白分析與載體選擇

將scFv-H4基因序列翻譯成蛋白質序列后，發(fā)現(xiàn)scFv-H4中有4個半胱氨酸。重鏈部分含有兩個半胱氨酸，分別位于可變區(qū)的第一框架區(qū)和第三框架區(qū)，形成連接上下兩個反平行的β-片層的二硫鍵，而輕鏈部分也含有兩個半胱氨酸，分別位于可變區(qū)的第一框架區(qū)和第三框架區(qū)，也形成二硫鍵以連接上下兩個反平行的β-片層。這兩個保守的二硫鍵的形成對維持scFv-H4的兩個結構域的正確構象具有重要意義。重組蛋白在細菌菌體中的大量表達會導致外源蛋白來不及正確折疊，形成不可溶的包涵體，蛋白包涵體一般都沒有生物活性；一般大腸桿菌的還原性細胞質不利巰基氧化成二硫鍵，所以含二硫鍵的蛋白質形成包涵體的概率很大。經Wilkinson- Harrison模型預測[18]，當scFv-H4在大腸桿菌中過量表達時，scFv-H4有高達96.5%的傾向以不溶的狀態(tài)聚集，形成包涵體。為了今后研究的方便，希望scFv-H4以生物活性的形式表達。

對于具有二硫鍵的蛋白來說，如何使重組蛋白中二硫鍵正確形成是表達有生物活性的抗體片段的關鍵。要使scFv-H4形成正確的二硫鍵有兩種策略：一是將scFv-H4轉運到周質中，周質中的氧化性環(huán)境有利于二硫鍵的形成；二是讓scFv-H4與能夠增加蛋白溶解性的標簽融合，這些融合標簽是高度可溶的多肽，可以增加目標蛋白的溶解性，進而促進二硫鍵的形成。

針對以上兩種策略，本實驗采用4種p E T載體(pET20b、pET22b、pET28a、pET32a)來表達scFv-H4。這4種載體有著諸多不同，比如啟動子、篩選標記和其他載體元件(表1)。pET20b上的多克隆位點的N端有一個pelB信號肽序列，用以引導目標蛋白穿過細胞內膜，分泌到周質空間中，啟動子為T7。pET22b的多克隆位點的N端也有一個pelB信號肽序列，但其啟動子為T7lac，比T7啟動子能更嚴謹?shù)乜刂颇繕说鞍椎谋磉_，降低目標蛋白在沒有誘導劑存在時的本地表達。pET28a載體不含pelB信號肽，所表達的產物主要在細胞質中積累。pET32a在多克隆位點的N端有一個109個氨基酸殘基的硫氧還原蛋白基因，能夠增加蛋白的溶解性，也可以在trxB突變宿主菌的細胞質中催化二硫鍵的形成。

表1 4種pET載體的比較Table 1 Comparison of four vectors for scFv-H4 expression

2.2 用不同的載體表達scFv-H4

根據(jù)scFv-H4的蛋白序列估算scFv-H4的分子質量大小為29kD，加上信號肽等，最終由大腸桿菌表達的蛋白分子質量大小應為31kD左右，由圖1A可見，純化后的scFv-H4約為31kD。比較含pET20b/H4和pET22b/ H4的E.coli BL21(DE3)的未誘導的細胞總蛋白(TCP)發(fā)現(xiàn)，未誘導的TCP明顯多于誘導后的TCP，這與圖1B中的菌體生物量在未誘導的條件下也明顯高于誘導條件下的現(xiàn)象一致；誘導后的TCP在31kD處有明顯的增強條帶，該條帶應該是由誘導產生的scFv-H4。圖1B中的ELISA信號能反映scFv-H4的生物活性，也可以發(fā)現(xiàn)誘導后菌體破碎液中ELISA信號大大高于未誘導的菌體破碎液。而在用pET28a表達scFv-H4的實驗中，無論誘導與否，菌體的生物量、TCP和ELISA結果都差別不大，說明pET28a不能夠用以表達scFv。在采用pET32a作為載體的實驗中，scFv-H4與硫氧還原蛋白(Trx)形成融合蛋白表達，分子質量大小約為44kD。比較含有pET32a/H4的E.coli BL21(DE3)在誘導和非誘導情況下的TCP可以發(fā)現(xiàn)，誘導后的TCP比未誘導的情況下

明顯減少，這一點也可以通過檢驗培養(yǎng)物的生物量來驗證(圖1B)；而在IPTG的誘導下，44kD附近有明顯的條帶產生，這就是scFv-H4-Trx融合蛋白。但圖1B中顯示含pET32a的經誘導后E.coli BL21(DE3)菌體破碎液沒有明顯生物活性，所以該融合蛋白可能是以包涵體的形式存在。下一步將pET32a在細胞質呈氧化性的E.coli Origami(DE3)中表達scFv-H4。

圖2 在E.coliOrigami (DE3)中，用pET32a表達scFv-H4時的TCP和包涵體Fig.2 TCP profile and inclusion body of scFv-H4 expressed with pET32a vector inE. coliOrigami (DE3)

圖1 用不同的pET載體表達scFv-H4Fig.1 Expression of scFv-H4 inE. coliBL21(DE3) using different pET vectors

2.3 在E.coli Origami(DE3)中，pET32a也不能表達有生物活性的scFv-H4

用pET32a在E.coli BL21(DE3)中表達scFv-H4時，scFv-H4也沒有生物活性，但有大量融合蛋白的包涵體產生。大腸桿菌的細胞質中存在硫氧蛋白還原酶(trxB)和谷胱甘肽還原酶(gor)，保持了細胞質環(huán)境的還原性，所以scFv-H4中的半胱氨酸以巰基的形式存在，不能維持scFv-H4中重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的正確構象，可能導致scFv-H4沒有生物活性。而E.coli Origami(DE3)是硫氧蛋白還原酶和谷胱甘肽還原酶突變體，這進一步增強了二硫鍵的形成。然而在E.coli Orig ami(DE3)中，pET32a表達scFv-H4的結果也不是很理想。

由圖2可見，E.coli Origami(DE3)經過誘導后也大量表達了scFv-H4-Trx融合蛋白(第1、2泳道)，而這些融合蛋白絕大多數(shù)是以包涵體的形式存在(第3、4道)，而ELISA實驗信號為0.062±0.007(空白為0.048±0.004)。這說明在E.coli Origami(DE3)細胞破碎液中沒有明顯的scFv-H4生物活性。由此可見，細胞的氧化還原勢不是唯一決定scFv-H4正確折疊的因素，其他的因素比如分子伴侶可能也決定著scFv-H4的正確折疊。

2.4 嚴謹?shù)膯幼佑欣趕cFv-H4的表達

從2.2節(jié)的結果可以看出在E.coli BL21(DE3)宿主中，具有信號肽的載體pET20b和pET22b所表達的scFv-H4是有生物活性的。但是E.coli BL21(DE3)/pET20b/H4的菌體破碎液中的生物活性低于E.coli BL21(DE3)/pET22b/H4的菌體破碎液中的生物活性。pET20b和pET22b的載體的主要區(qū)別在于啟動子，pET22b由T7lac啟動，比pET20b的T7更加嚴格。從E. coli BL21(DE3)/pET20b/H4和E.coli BL21(DE3)/pET22b/H4培養(yǎng)的生長曲線(圖3A)和誘導過程中具有生物活性的scFv-H4的表達情況(圖3B)可以發(fā)現(xiàn)它們之間的區(qū)別。在尚未添加IPTG的時候，E.coli BL21(DE3)/pET20b/H4菌體破碎液已經能檢測到一定水平的scFv-H4生物活性，但E.coli BL21(DE3)/ pET22b/H4菌體破碎液并無明顯的scFv-H4生物活性被檢測到；添加了IPTG后，E.coli BL21(DE3)/pET20b/H4菌體破碎液scFv-H4生物活性有所上升，但上升的速度較慢，而E.coli BL21(DE3)/pET22b/H4在IPTG的誘導后菌體破碎液中scFv-H4生物活性快速上升。

T7啟動子由E.coli BL21(DE3)基因組上的T7 RNA聚合酶啟動，而T7 RNA聚合酶有l(wèi)acUV5啟動子控制表達。在沒有IPTG的情況下，也會有少量T7 RNA聚合酶表達，因此存在外源蛋白的本底表達。宿主需要耗費能量與資源去表達外源蛋白，這對宿主來說是一種代謝負擔，會或多或少影響到宿主的正常生理功能。在對數(shù)中期添加IPTG以解除對lacUV5的抑制(圖3A)，啟動目的基因的表達。在此之前，宿主需要有足夠的生

物量，這是大量表達目的蛋白的基礎。用pET20b表達scFv-H4時，由于T7啟動子不嚴謹，導致E.coli BL(DE3)/ pET20/H4有較高的本底表達(圖3B)，這影響了菌體的生長，此后的菌體量一直較低，從而影響了scFv-H4最終的表達水平。而pET22b能嚴謹?shù)乜刂苨cFv-H4的表達，在未添加IPTG時，scFv-H4的活性表達量很低，菌體生物量在對數(shù)期以及后面的穩(wěn)定期一直都處于比較高的水平；當添加IPTG后，有生物活性的scFv-H4迅速表達，且菌體破碎液中scFv-H4的生物活性明顯高于采用pET20b的情況。

圖3 含有pET20b和pET22b的E.coliBL21(DE3)在表達scFv-H4過程中的生長曲線(A)和期間具有生物活性的scFv-H4的表達情況(B)Fig.3 Growth curves ofE. coliBL21 (DE3) using pET20b and pET22b vectors and the bioactivity of scFv-H4 expressed by both constructs

2.5 用pET22b表達的scFv-H4在E.coli BL21(DE3)分布

pET22b是帶有信號肽的載體，能引導目標蛋白跨越細胞內膜，分泌于細胞周質中。本實驗通過培養(yǎng)物上清，細胞周質，細胞質可溶部分和細胞質不可溶部分的電泳圖來分析scFv-H4的分布。

從圖4可以發(fā)現(xiàn)，由于外膜的限制，很少有蛋白質能分泌到培養(yǎng)基中，在細胞周質中的蛋白質種類較少，但是有大量可溶性的scFv-H4；而在細胞質可溶部分僅有很少量的scFv-H4，細胞質中的scFv-H4基本上是以不溶性的包涵體形式存在。

2.6 scFv-H4特性的測定

由E.coli BL21(DE3)/pET22b系統(tǒng)表達的scFv-H4經純化后，用競爭ELISA測定其親和力。取質量濃度為0.5μg/mL的scFv-H4與不同質量濃度的AFB1溶液混合后，加入AFB1-BSA包被的酶標板中。

圖4 scFv-H4培養(yǎng)物各部分的分布情況Fig.4 Distribution of scFv-H4 in cell culture

圖5 scFv-H4的競爭ELISA結果Fig.5 Binding results of scFv-H4 to AFB1in competitive ELISA

圖5結果表明，scFv-H4的半抑制質量濃度(IC50)為0.4ng/mL。Moghaddam等[19]從未經免疫的人源抗體文庫中通過競爭洗脫篩選到的單鏈抗體的IC50為400ng/mL；而Daly等[20]從免疫過的小鼠單鏈抗體文庫中篩選到的抗體的 IC50為16ng/mL。相比較而言，scFv-H4更為敏感，能檢測到更低濃度的AFB1，所以這個抗體具有一定的應用價值。scFv-H4與AFB2有12%的交叉反應性，與AFG1有42%的交叉反應性，與AFG2有9%的交叉反應性[16]。

3 結 論

Wilkinson- Harrison模型預測表明當抗AFB1的scFv-H4在大腸桿菌中大量表達的時候，有96.5%的可能形成包涵體。為得到可溶的、有生物活性的scFv-H4，本實驗采用了4個不同的pET載體pET20b、pET22b、pET28a和pET32a來表達scFv-H4，其中pET20b和pET22b能將scFv-H4分泌到大腸桿菌的細胞周質中，而pET32a的表達產物則存在于細胞質中。

pET20b和pET22b能用來表達有生物活性的scFv-H4，而pET22b的T7lac啟動子能嚴謹?shù)乜刂苨cFv-H4的本底表達，從而避免由于誘導后scFv-H4的表達影響對數(shù)前

期的細胞生長。pET22b表達的scFv-H4分為兩部分：分泌到細胞周質中的有生物活性的可溶性蛋白和在細胞質中的包涵體。而采用pET20b作為表達載體時，scFv-H4的本底表達比較高，影響了細菌本身的生長和新陳代謝。

pET28a不能用來表達scFv-H4，實驗結果顯示沒有明顯的scFv-H4蛋白產生。帶有Trx標簽的載體pET32a在E.coli BL21(DE3)中能表達大量的Trx-scFv-H4融合蛋白，但是都沒有生物活性，把宿主換為細胞質呈氧化性的E.coli Origami(DE3)后，情況并沒有特到改善，所以scFv-H4的正確折疊可能不僅局限于分子中二硫鍵的因素，還需要考慮其他的影響因素如分子伴侶等。

E.coli BL(DE3)/pET22b這樣的表達系統(tǒng)不僅有利于scFv-H4的表達，也可能為此類蛋白的表達提供參考；并有可能為以后的抗體親和力成熟和穩(wěn)定性改進奠定良好的基礎。

[1]SMLA M E, CURRIER S S, BAILEY E A, et al. The chemistry and biology of aflatoxin B1∶ from mutational spectrometry to carcinogenesis [J]. Carcinogenesis, 2001, 22(4)∶ 535-545.

[2]PAKNEJAD M, JAVADRASAEE M, MOHAMMADNEJAD J, et al. Development and characterization of enzyme-linked immunosorbent assay for aflatoxin B1 measurement in urine sample using penicillinase as label[J]. Journal of Toxicological Science, 2008, 33(5)∶ 565-573.

[3]GRANT S D, PORTER A J, HARRIS W J. Comparative sensitivity of immunoassays for haptens using monomeric and dimeric antibody fragments[J]. Journal Agricultural and Food Chemistry, 1999, 47(1)∶340-345.

[4]HILL A S, GIERSCH T M, LOH C S, et al. Immunoassay for wheat processing quality∶ utilization of a sandwich assay incorporating an immobilized single-chain fragment[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1999, 47(10)∶ 4484-4490.

[5]YAJIMA W, RAHMAN M H, DAS D, et al. Detection of Sclerotinia sclerotiorum using a monomeric and dimeric single-chain fragment variable (scFv) antibody[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2008, 56(20)∶ 9455-9463.

[6]LIM K P, LI H, NATHAN S. Expression and purification of a recombinant scFv towards the exotoxin of the pathogen, Burkholderia pseudomallei [J]. Journal of Microbiology, 2004, 42(2)∶ 126-132.

[7]YANG J, MOYANA T, MACKENZIE S. One hundred seventy-fold increase in excretion of an FV fragment-tumor necrosis factor alpha fusion protein (sFV/TNF-alpha ) from Escherichia coli caused by the synergistic effects of glycine and Triton X-100[J]. Applied Environmental Microbiology, 1998, 64(8)∶ 2869-2874.

[8]SANTALA V, LAMMINMAKI U. Production of a biotinylated singlechain antibody fragment in the cytoplasm of Escherichia coli[J]. Journal of Immunological Methods, 2004, 284(1)∶ 165-175.

[9]SORENSEN H P, MORTENSEN K K. Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli[J]. Journal of Biotechnology, 2005, 115(2)∶ 113-128.

[10]REN F, LI B C, ZHZANG N N, et al. Expression, purification and characterization of anti-BAFF antibody secreted from the yeast Pichia pastoris[J]. Biotechnology Letters, 2008, 30(6)∶ 1075-1080.

[11]SHI X, KARKUT T, CHAMANKHAH M, et al. Optimal conditions for the expression of a single-chain antibody (scFv) gene in Pichia pastoris[J]. Protein Expression and Purification, 2003, 28(2)∶ 321-330.

[12]SCHOUTEN A, ROOSIEN J, de BORE J M, et al. Improving scFv antibody expression levels in the plant cytosol[J]. FEBS Letters, 1997, 415(2)∶ 235-241.

[13]ARTSAENKO O, PEISKER M, ZURNIEDEN U, et al. Expression of a single-chain Fv antibody against abscisic acid creates a wilty phenotype in transgenic tobacco[J]. Plant Journal, 1995, 8(5)∶ 745-750.

[14]HU Y C. Baculovirus as a highly efficient expression vector in insect and mammalian cells[J]. Acta Pharmacology Sinica, 2005, 26 (4)∶ 405-416.

[15]MILLER K D, WEAVER-FELDHAUSE J, GRAY S A, et al. Production, purification, and characterization of human scFv antibodies expressed in Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, and Escherichia coli[J]. Protein Expression and Purification, 2005, 42 (2)∶ 255-267.

[16]YANG Lian, DING Husheng, GU Zhennan, et al. Selection of single chain fragment variables with direct coating of aflatoxin B1 to enzymelinked immunosorbent assay plates[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 57(19)∶ 8927-8932.

[17]SORENSEN H P, MORTENSEN K K. Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli[J]. Microbiology Cell Factory, 2005, 4(1)∶ 1-8.

[18]SMIALOWSKI P, MARTIN-GALIANO A J, MIKOLAJKA A, et al. Protein solubility∶ sequence based prediction and experimental verification [J]. Bioinformatics, 2007, 23(19)∶ 2536-2542.

[19]MOGHADDAM A, LOBERSLI I, GEBHARDT K, et al. Selection and characterization of recombinant single-chain antibodies to the hapten aflatoxin-B1from naive recombinant antibody libraries[J]. Journal of Immunological Methods, 2001, 254(1)∶ 169-181.

[20]DALY S, DILLON P, MANNING B, et al. Production and characterization of murine single chain Fv antibodies to aflatoxin B1 derived from a pre-immunized antibody phage display library system[J]. Food and Agricultural Immunology, 2002, 14(4)∶ 255-274.

Comparison of pET Vectors for the Expression of Single Chain Antibody for Aflatoxin B1

YANG Lian，LIU Zi-qin，LIU Rong，CHEN Hai-qin，CHEN Wei，ZHANG Hao*
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Objective∶ Recombinant antibody expression in microorganism greatly facilitated the affinity and stability studies of recombinant antibodies, but previous studies had less reports about the selection of vectors. A suitable expression vector is important during the expression of the single chain antibody (scFv-H4) for aflatoxin B1. Methods∶ Four pET vectors such as pET20b, pET22b, pET28a and pET32a were employed in the functional expression of scFv-H4. Results∶ pET20b and pET22b vectors were able to express the functional antibody in periplasm. The vector of pET28a was not suitable for the expression of scFv-H4 due to lack of detectable scFv-H4 in total protein. Moreover, the detectable scFv-H4 was only expressed in inclusion body through pET32a expression system. Conclusion∶ pET22b was an excellent vector for the expression of scFv-H4, which might be a good reference for similar protein expression and be useful in the later study of scFv-H4 affinity and stability.

aflatoxin；single chain fragment；expression；Escherichia coli；pET

Q782

A

1002-6630(2010)09-0171-06

2009-10-24

教育部新世紀人才計劃資助項目(NCET-06-0482)

楊煉(1978—)，男，博士研究生，研究方向為食品生物技術。E-mail：yanglian27@yahoo.com.cn

*通信作者：張灝(1962—)，男，教授，研究方向為食品生物技術。E-mail：zhanghao@jiangnan.edu.cn