孫 旸， 孫春玉， 陳 光*

(吉林農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，吉林 長春 130118)

大豆分離蛋白水解物降血壓活性的體外檢測

孫 旸， 孫春玉， 陳 光*

(吉林農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，吉林 長春 130118)

采用Alcalase酶處理大豆分離蛋白，對產(chǎn)物及其層析組分的降血壓活性進行研究，結果表明Alcalase酶處理大豆分離蛋白產(chǎn)物具有一定的降血壓活性；通過分子篩層析分離后，所得小分子組分降血壓活性較高；增加外切酶處理可以改善水解產(chǎn)物的口味，但與不加酶處理相比其降血壓活性降低。

大豆分離蛋白；Alcalase蛋白酶；水解；降血壓活性

大豆功能性低聚肽是大豆蛋白經(jīng)蛋白水解酶作用后，再經(jīng)過特殊處理而得到的低肽混合物，具有許多生理功能，如降低膽固醇、抑制血壓升高、增強免疫功能和抗自由基損傷等[1-2]。血管緊張素轉化酶(angiotensin converting enzyme，ACE)在人體內(nèi)通過腎素-血管緊張素系統(tǒng)和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)參與血壓的調(diào)節(jié)：通過ACE作用于血管緊張素Ⅰ，從其C末端去掉His-Leu生成血管緊張素Ⅱ，血管緊張素Ⅱ作用于小動脈，使血管平滑肌收縮，從而引起血壓升高。服用ACE的抑制劑可減少血管緊張素Ⅱ的生成，達到治療高血壓的目的[3-4]。多種人工合成或由蛋白質(zhì)降解得到的短肽都可在一定程度上抑制血管緊張素轉移酶的活性起到降血壓的功效[5-7]。大豆肽能抑制ACE活性，而對正常血壓沒有降壓作用，安全可靠[8]。本實驗采用Alcalase酶解大豆分離蛋白，對所得的大豆肽及其層析分離組分的降血壓活性進行研究，以期提高大豆產(chǎn)品的附加值，為大豆肽作為新一代蛋白營養(yǎng)素和多功能保健物質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

Alcalase堿性內(nèi)切蛋白酶、Flavourzyme風味蛋白酶 丹麥Novo公司；金龜2200大豆分離蛋白 吉林不二蛋白有限公司；考馬斯亮蘭 G-250 Fluka公司；葡聚糖凝膠Sephadex G-50 Pharmacia公司；HHL(Hip-His-Leu)、ACE (兔肺血管緊張素轉化酶) Sigma公司。

Agilent 1100型高效液相色譜儀和C18反相色譜柱 美國Agilent公司；UV-1100型紫外-可見分光光度計 北京瑞利分析儀器公司；DELTA 320 pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；LG-3型冷凍干燥機 寧波市生化儀器廠； HD-21-1核酸蛋白檢測儀、BSZ-100自動部分收集器 上海青浦滬西儀器廠；XWT-S小型臺式記錄儀 上海自動化儀表三廠；層析柱(4cm×100cm) 上海錦華層析設備廠。

1.2 方法

1.2.1 酶活力的測定

酶活力測定采用福林酚法[9]。

1.2.2 大豆肽的酶水解

Alcalase酶水解大豆分離蛋白參照文獻[10]中的工藝。

1.2.3 水解度(DH)的測定

水解度測定采用pH-Stat法[11]。

1.2.4 水解產(chǎn)物的層析分離

采用G-50葡聚糖凝膠對混合肽進行分子篩層析分離。柱末端與核酸蛋白檢測儀、記錄儀相聯(lián)，柱參數(shù)為：柱徑4cm、填料高度80cm、檢測波長254nm、流速3.5mL/min、加樣量為25mL、室溫下以蒸餾水進行洗脫。

1.2.5 分子質(zhì)量分布的測定

采用SDS-PAGE不連續(xù)電泳[12]方法。

1.2.6 降血壓活性測定

參照文獻[13]方法。HHL(Hip-His-Leu)與血管緊張素Ⅰ的C末端結構類似，可作為ACE催化反應的底物。本實驗中以ACE催化降解HHL，反應在40℃恒溫水浴中進行，通過高效液相色譜分離并檢驗產(chǎn)物馬尿酸的含量。HPLC色譜分析條件為：C18分析型色譜柱；檢測波長：228nm；流速：0.5mL/min；上樣量：6μL，自動進樣；緩沖液A：水(含體積分數(shù)為0.05%的冰醋酸)，緩沖液B：乙腈(含體積分數(shù)為0.05%的冰醋酸)；梯度洗脫：0～30%(45min)緩沖液B；柱溫：25℃。

ACE受到抑制會使馬尿酸的產(chǎn)量減少，以馬尿酸產(chǎn)量相對于空白實驗減少的百分率代表大豆肽及其層析組分的ACE抑制率。

式中：Si為i組分作用下生成馬尿酸的峰面積；S0為空白實驗中生成馬尿酸的峰面積。

2 結果與分析

2.1 水解度測定

采用pH-Stat法測定水解度為22.02%。

2.2 水解混合肽的分離效果

大豆分離蛋白經(jīng)Alcalase堿性蛋白酶水解后，所得到的是各種肽的混合物，根據(jù)分子篩分離原理，采用葡聚糖凝膠G-50對混合肽進行分離，以提取活性組分，圖1為Alcalase酶解產(chǎn)物分離圖譜。

由圖1可知，G-50凝膠可將混合肽按分子質(zhì)量分成5種組分，前3種含量較大，而后兩種較低，5個峰的分離效果較好。將G-50凝膠分離單酶水解混合肽所得的5種組分分別收集，記為層析組分1～5。各組分濃縮后進行SDS-PAGE凝膠電泳，以檢驗凝膠分離的效果，并確定各組分的分子質(zhì)量，見圖2。

圖1 G-50凝膠對單酶水解混合肽的分離效果Fig.1 Separation effect of Sephadex G-50 on hydrolysates by a single enzyme

圖2 G-50凝膠分離各組分的電泳圖譜Fig.2 Electrophoresis pattern of all components using Sephadex G-50

由圖2可見，G-50凝膠分離單酶水解混合肽所得5種組分中：層析組分1～3條帶清晰；層析組分4、5經(jīng)濃縮后仍不能顯示清晰的條帶，認為是由于此兩種組分的分子質(zhì)量較小已經(jīng)跑出分離膠所致，或是由于在實驗的染色條件不適合小肽的顯色。分別計算圖2中各組分的遷移率，以分子質(zhì)量標準品的遷移率作遷移率關于分子質(zhì)量對數(shù)的標準曲線，并求出其回歸方程為y =－1.958x+4.9487。將凝膠分離得到的顯色清晰的3種組分的遷移率代入該方程，計算其平均分子質(zhì)量分別約為22550、13548、3517u，標準曲線見圖3。

圖3 G-50凝膠分離單酶水解混合肽所得各組分的分子質(zhì)量Fig.3 Molecular mass of hydrolysates separated by Sephadex G-50

2.3大豆肽的降血壓活性(ACE抑制率)

圖4 空白(無抑制劑)色譜圖Fig.4 Chromatograph of blank sample without inhibitory agents

圖5 Alcalase酶解產(chǎn)物抑制ACE活性效果色譜圖Fig.5 Inhibitory effect of hydrolysates through alcalase hydrolysis on ACE

圖6 層析組分1抑制ACE活性效果色譜圖Fig.6 Inhibitory effect of fractionⅠ on ACE

圖7 層析組分2抑制ACE活性效果色譜圖Fig.7 Inhibitory effect of fraction Ⅱ on ACE

圖8 層析組分3抑制ACE活性效果色譜圖Fig.8 Inhibitory effect of fractionⅢ on ACE

馬尿酸分子質(zhì)量小，保留時間短而先出峰，其峰面積代表了馬尿酸的產(chǎn)量。與空白實驗相比，添加大豆蛋白的酶解產(chǎn)物及其層析分離組分都能使馬尿酸的產(chǎn)量減少，即對ACE的活性起到抑制作用。Alcalase酶解產(chǎn)物具有較強的ACE抑制活性，為明確其中的活性組分，又用葡聚糖凝膠色譜對其進行分離，分別進行ACE抑制活性研究，結果見圖4～8。

Alcalase酶解產(chǎn)物對ACE活性的抑制率達31.4% (圖5)；層析組分1、2、3對ACE抑制率分別為7.9%、24.7%和39.7%(圖6～8)，其質(zhì)量分數(shù)分別達到總水解物的14.1%、7.8%和62.5%；總體看來ACE抑制活性有隨水解物分子質(zhì)量減小而加強的趨勢。實驗中采用Flavourzyme風味蛋白酶進行雙酶作用，經(jīng)雙酶連續(xù)作用后大豆蛋白水解產(chǎn)物的苦味明顯減少，但經(jīng)檢測，其ACE抑制率僅有12.5%，尚不足單酶水解產(chǎn)物的一半。分析可能的原因為ACE屬于外切酶，其抑制劑的C端結構對抑制活性影響較大，而Flavourzyme風味蛋白酶具有外切酶活性，破壞了抑制劑的C端的結構，導致活性的下降[14-16]。

3 結 論

對Alcalase酶處理大豆分離蛋白產(chǎn)物及其層析組分的降血壓活性進行研究，結果表明Alcalase酶水解大豆分離蛋白產(chǎn)物具有一定的降血壓效果，其ACE活性抑制率達31.4%；Alcalase酶水解大豆分離蛋白產(chǎn)物抑制ACE活性有隨水解物分子質(zhì)量減小而加強的趨勢；引入外切酶作用可能會破壞Alcalase酶水解大豆分離蛋白產(chǎn)物中抑制ACE活性成分結構。

[1]ADLER-NISSEN J. Dtermination of the degree of hydrolysis of food protein hydrolyzates by trinitrobenzene sulfonnicacid[J]. Agric Food Chem, 1989, 27∶ 17-20.

[2]黃驪虹. 大豆肽生理功能及應用(一)[J]. 食品科技, 1999(3)∶ 50-51.

[3]COSTA-NETO C M, DILLENBURG-PILLA P, HEINRICH T A, et al. Participation of kallikrein-kinin system in different pathologies[J]. Inter-

national Immunopharmacology, 2008, 8(2)∶ 135-142.

[4]陳多錦. 血管緊張素轉化酶的生物化學及其應用[J]. 生理科學, 1983, 3(2)∶ 24-36.

[5]OSHIMA G, SHIMABUKURO H, NAGASAWA K. Peptide inhibitors of angiotensin-converting enzyme in digest s of gelatin by bacterial collagenase[J]. Biochimicaet Biophysica Acta, 1979, 566∶ 128-137.

[6]陳季旺, 孫勤, 夏文水. 魚降壓肽的大孔吸附樹脂分離及其活性穩(wěn)定性[J]. 食品科學, 2009, 30(18)∶ 25-28.

[7]KAWAMURA Y. Food protein and antihypretensive peptides[J]. Farming Japan, 1997, 31(1)∶ 14-19.

[8]吳建平, 丁霄霖. 食品蛋白質(zhì)降血壓肽的研究進展[J]. 中國糧油學報, 1998, 13(5)∶ 10-14.

[9]諸葛健, 王正祥. 工業(yè)微生物試驗技術手冊[M]. 北京∶ 中國輕工業(yè)出版社, 1994∶ 205-209.

[10]孫旸, 陳光, 劉艷秋. Alcalase 堿性蛋白酶水解大豆分離蛋白的研究[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學學報, 2005, 27(2)∶ 162-166.

[11]ADLER-NISSEN J. Newer uses of microbial enzymes in food processing [J]. Trends in Biotechnology, 1987, 5(6)∶ 170-174.

[12]石繼紅, 趙永同, 王俊樓, 等. SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析小分子多肽[J]. 第四軍醫(yī)大學學報, 2000, 21(6)∶ 761-763.

[13]CUSHMAN D W, CHEUNG H S. Spectrophotometric assay and properties of the angiotensin converting enzyme of rabbit lung[J]. Biochemical Pharm, 1971, 20∶ 1637-1645.

[14]KUBA M, TANAKA K, SESOKO M, et al. Angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides in red-mold rice made by Monascus purpureus [J]. Process Biochemistry, 2009, 44(10)∶ 1139-1143.

[15]MARUYAMAS S, SUZUKI H. A peptide inhibitor of angiotensin I -converting enzyme in the tryptic hydrilysis of casein[J]. Agric Biol Chem, 1982, 46(5)∶ 1393-1394.

[16]MATSUI T, MATSUFUJI H, SEKI E, et al. Inhibition of angiotensin converting enzyme by Bacillus licheniformis alkaline protease hydrolyzates derived from sardine muscle[J]. Biosci Biotech Biochem, 1993, 57(6)∶ 922-925.

in vitro Hypotensive Effect of Hydrolyzed Soybean Protein

SUN Yang，SUN Chun-yu，CHEN Guang*
(College of Life Sciences, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

Soybean protein hydrolysates were prepared by enzymatic hydrolysis with alcalase. Inhibitory activities of enzymatic hydrolysates and the purification fractions to angiotensin I converting enzyme (ACE) were determined for evaluating their hypotensive effects. Results showed that both enzymatic hydrolysates and purified fractions with smaller molecular weights exhibited higher hypotensive activity. However, exonuclease treatment could result in the improvement of flavor and reduction of hypotensive activity for hydrolysates.

soybean protein；alcalase；hydrolysis；hypotensive effect

R151.2

A

1002-6630(2010)09-0272-04

2009-10-13

吉林省科技發(fā)展重點項目(20070207)

孫旸(1976—)，男，講師，博士研究生，研究方向為酶工程。E-mail：robsuny@163.com

*通信作者：陳光(1961—)，女，教授，博士，研究方向為酶工程。E-mail：chg61@163.com