李 峰，明艷紅，李媛媛，潘 瑤，陳 奇

(淮北煤炭師范學院生命科學學院，資源植物學安徽省重點實驗室，安徽 淮北 235000)

產(chǎn)果香菌株的初步鑒定及香味成分分析

李 峰，明艷紅，李媛媛，潘 瑤，陳 奇

(淮北煤炭師范學院生命科學學院，資源植物學安徽省重點實驗室，安徽 淮北 235000)

對從安徽碭山果園土壤中分離出的產(chǎn)果香菌進行純化和菌種形態(tài)特征研究，初步鑒定該菌株為地霉屬。采用頂空-固相微萃取法(HS-SPME)結(jié)合氣-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)分析產(chǎn)生的具有水果香味的物質(zhì)，結(jié)果表明，其主要成分為酯類和醇類，其中最多的是酯類，共32種，占總量的73.84%；醇類物質(zhì)8種，占12.53%。

產(chǎn)果香菌株；生長曲線；香氣成分；氣-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)

隨著經(jīng)濟的發(fā)展和人們生活水平的提高，消費者在追求食品健康、營養(yǎng)、衛(wèi)生的同時也看重色澤、口味。各種可以食用的香料和人工色素在食品配料中所占的比例雖然很小，但卻對食品色澤、口味起著舉足輕重的作用。香料對原有食物的口味有輔助、穩(wěn)定、補充等作用[1]。香料的主要成分為脂類和醇類；香料的生產(chǎn)方法主要有化學合成、動植物提取以及微生物發(fā)酵法。隨著生物技術(shù)日新月異的發(fā)展，生物法生產(chǎn)香料的工作已取得了很多進展。目前，已經(jīng)得到應用的產(chǎn)香微生物主要包括生香活性干酵母(生香ADY)[2]、假絲酵母、乳酸菌、黑曲霉等。這些產(chǎn)香微生物主要應用于酒類、食醋、香料、面包、煙用香料以及果汁等。如用婁地青霉生產(chǎn)甲基酮；以5-十二酮酸為起始原料，采用面包酵母生產(chǎn)R-δ-十二酸酐；用熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)發(fā)酵相應的烷烴生產(chǎn)二梭酸；以乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)丁二酮和乙醛[3-4]，以棕桐酸為原料，由球擬酵母(Torulopsis bombicola)將其轉(zhuǎn)化為相應的酯或十六烷；用微生物細胞或生物酶催化合成甜味、水果型香料。酵母菌可以部分代謝L-苯基苯胺，包括脫氨基、脫羧基，然后還原，用溶劑萃取發(fā)酵液的方法回收產(chǎn)品。這一工藝采用了豐富、價廉的苯基苯胺，它也用于生產(chǎn)高強度甜味劑阿斯巴甜。微生物發(fā)酵法與化學合成、動植物提取相比具有很大的優(yōu)勢，這主要是因為微生物的生長周期短、培養(yǎng)簡單，不受原料限制；利用微生物制取的香料產(chǎn)物天然、健康安全，既可以降低成本，又可以提高香料的產(chǎn)量，彌補資源的不足，有利于香料大量地被利用，使生產(chǎn)廠家與消費者均受益。固相微萃取(SPME)與氣-質(zhì)聯(lián)用儀(GC-MS)聯(lián)用的方法對水果的香氣成分測定簡單有效，已被應用在歐李、菠蘿等水果的香氣成分測定上[5-6]。雖然產(chǎn)香菌已經(jīng)在一些領(lǐng)域得到了很好的應用，但其領(lǐng)域仍不夠廣泛，有待于進一步拓寬。并且，有些參數(shù)還需要進一步的進行實驗，以達到更好的效果。

本研究對從安徽碭山果園土壤中分離出的產(chǎn)果香菌進行分離純化、菌種鑒定以及生長曲線的描繪，利用頂空-固相微萃取法(HS-SPME)結(jié)合氣-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(GCMS)分析所產(chǎn)生的水果香味的成分，旨在為該菌在食用香料生產(chǎn)中的應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1 菌株

菌株P(guān)Y03分離于果樹下15cm的土壤中。

1.1.2 培養(yǎng)基

初篩培養(yǎng)基：YEPD培養(yǎng)基[7]，外加硫酸鏈霉素1‰；純化培養(yǎng)基：YPD培養(yǎng)基；搖瓶培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基。

1.1.3 儀器與設(shè)備

SW-CJ-IF型凈化工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；CCS4S恒溫培養(yǎng)搖床 長沙科威實業(yè)有限公司；HPX-9272MBE數(shù)顯不銹鋼電熱培養(yǎng)箱、YXQ-LS-75SII立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；HS-SFME裝置 美國Supelco公司；TraceMS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Finnigan質(zhì)譜公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株篩選

從果園中果樹下15cm的土壤中采集土樣，通過初篩培養(yǎng)基進行初步篩選，重復3次；再通過純化培養(yǎng)基進行菌株純化，重復3次；然后進行菌落的含水狀態(tài)、外觀形態(tài)、與培養(yǎng)基結(jié)合程度、顏色、正反面顏色、透明度、邊緣、氣味觀察以及通過采用純化培養(yǎng)基制備顯微鏡小室通過培養(yǎng)進一步觀察；重復以上步驟。最后對這株果香菌進行生長曲線的繪制以及采用PDA培養(yǎng)基斜面在4℃進行菌株保存。

初篩和復篩都是在28℃進行培養(yǎng)，其他沒有特別說明培養(yǎng)溫度均為28℃。

1.2.2 產(chǎn)物的生理生化分析

1)形態(tài)學鑒定：進行菌落的觀察以及顯微鏡小室培養(yǎng)觀察；2)生理生化鑒定：根據(jù)真菌學知識[8]對實驗菌株生理生化特性進行實驗和觀察；3)對菌株生長曲線的測定：將純化菌株接種于液體培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)12h。無菌條件下，以10%的體積分數(shù)將菌懸液加入到液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，每3h取樣，以5000r/min的速度離心15min，倒出上清液用蒸餾水清洗沉淀物兩次后，收集菌絲體置于60℃電熱鼓風干燥箱中烘干至恒質(zhì)量，電子天平準確稱量，得菌絲濕質(zhì)量(生物量)。以時間為橫坐標，以菌絲濕質(zhì)量為縱坐標，繪生長曲線。

1.2.3 菌發(fā)酵液的初步分析

取菌發(fā)酵液200mL，置于1000mL分液漏斗中，分別用150、100、40mL二氯甲烷萃取3次；然后用無水硫酸鈉干燥，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行濃縮，得到具有香味的淡紅色液體，取10滴加入含飽和氯化鈉溶液的試管中。

1.2.4 菌發(fā)酵液香味成分的GC-MS分析

1.2.4.1 菌發(fā)酵液香氣成分的固相微萃取[9-10]

首先將固相微萃取裝置的萃取頭在氣相色譜的進樣口老化，老化溫度250℃，老化時間2h。取6mL菌液，置于15mL樣品瓶中，放入轉(zhuǎn)子在45℃恒溫。將固相微萃取器的萃取頭插入到樣品瓶中，抽出纖維頭(注意萃取頭不要碰到菌液)，打開磁力攪拌使轉(zhuǎn)子在菌發(fā)酵液中迅速轉(zhuǎn)動，吸附36min，隨后縮回纖維頭，從樣品瓶中拔出萃取頭，再將萃取頭直接插入氣相色譜儀，推出纖維頭，于250℃解析2min，用于GC-MS分析。

1.2.4.2 色譜條件

氣譜條件：色譜柱：PEG(30m×0.25m，0.25μm)；程序升溫：40℃保持4min，5℃/min升溫至90℃，10℃/min升溫至230℃，保持5min。載氣He，流速0.80mL/min，檢測器溫度250℃，入口溫度250℃。

質(zhì)譜條件：EI電離源，電子能量70eV。離子源溫度200℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的形態(tài)學鑒定

2.1.1 菌落觀察

生長較快，培養(yǎng)12h即可長出白色菌落，菌落平板如圖1。

圖1 菌株平板劃線觀察Fig.1 Observation of strain of streak plate

2.1.2 顯微鏡小室培養(yǎng)觀察

將分離到的菌種，于顯微鏡下觀察；結(jié)果如圖2A、2B

圖2 菌體形態(tài)Fig.2 Morphology of the strain

該菌菌落呈平面擴散、生長快、扁平、乳白色、短絨狀或近于粉狀、干燥。有同心圈和放射線，有的

呈中心突起。在液體培養(yǎng)基中生白醭，褶皺薄膜，培養(yǎng)液混濁，呈絮狀沉淀。光學顯微鏡下觀察，有單細胞和多細胞真菌絲及假菌絲混雜在一起，裂殖，菌絲為有橫隔的真菌絲，有的為二叉分枝。菌絲成熟后斷裂成單個或成鏈、長筒形、末端鈍圓的節(jié)孢子。

2.2 產(chǎn)物的生理生化特性分析

菌株的糖發(fā)酵實驗和部分生理生化實驗結(jié)果分別見表1～3。

表1 菌株的糖發(fā)酵實驗Table 1 Sugar fermentation test of strains

表2 菌株對碳源的同化Table 2 Carbon assimilation of strains

表3 菌株生理實驗Table 3 Physiologycal experiments of strains

由表1～3可知：菌株對對糖發(fā)酵的能力較弱，對碳源的同化能力較弱，對溫度、NaCl、葡萄糖的耐性也較差。

根據(jù)實驗結(jié)論結(jié)合真菌學知識[8]鑒定該菌為半知菌亞門，絲孢綱，絲孢目，叢梗孢科，地霉屬。

2.2.1 液體發(fā)酵實驗觀察

將純化菌株接種于搖瓶液體培養(yǎng)基中(250mL三角瓶中加入100mL液體培養(yǎng)基)，200r/min，26℃，振蕩培養(yǎng)3d。培養(yǎng)12h即可觀察到發(fā)酵液變渾濁并開始慢慢變紅，培養(yǎng)24h即可聞到菠蘿和香蕉的香味。

2.2.2 生長曲線的繪制

從該菌的生長曲線可以看出，該地霉屬菌株24h即可進入穩(wěn)定期，48h后進入衰亡期。

圖3 菌株的生長曲線Fig.3 Growth curve of the strain

2.3 菌液產(chǎn)物的分析

2.3.1 產(chǎn)物的初步分析

具有香味的淡紅色液體加入含飽和氯化鈉溶液的試管后出現(xiàn)分層現(xiàn)象，上層為紅色的發(fā)酵液，下層為水。紅色的發(fā)酵液能夠被飽和氯化鈉溶液萃取，根據(jù)相似相溶原理可知紅色的發(fā)酵液應為非極性物質(zhì)。

2.3.2 GC-MS結(jié)果分析

采用HS-SPME結(jié)合GC-MS從菌株發(fā)酵液中提取并分離得到51種化合物，如圖4所示。通過NIST/WELLY標準譜庫數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，并結(jié)合有關(guān)文獻標準圖譜進行核對分析，共鑒定出其中46種香氣組分。采用色譜面積歸一化法計算已定性的香氣物質(zhì)的相對含量，結(jié)果見表4。

圖4 菌株發(fā)酵液香氣成分GC-MS總離子流圖Fig.4 GC-MS total ion current chromatogram of aroma components from fermented media

香氣成分通常是指那些通過味覺和嗅覺感覺到的物質(zhì)。揮發(fā)性香氣物質(zhì)約2 0 0 0種，包括酯類、醛類、內(nèi)脂類、萜類、醇類、羰基化合物和一些含硫化合物等[11]。表4顯示，鑒定出的46種組分峰面積之和占總離子流出色譜峰面積的88.11%。這些香氣成分包括酯類、醇類、醛類、萜類、芳香烴類等成分。在已鑒定的香氣組分中，種類最多的是酯類，共32種，其含量占總量的73.84%；醇類物質(zhì)8種，占12.53%；萜類物質(zhì)3種，占1.70%；醛類物質(zhì)1種，占0.33%；芳香烴類物質(zhì)2種，占0.31%。

表4 菌株發(fā)酵液主要香氣成分GC-MS分析結(jié)果Table 4 GC-MS analysis results of aroma components from fermented media

從單一香氣成分及香氣成分的感官特征方面分析，菌發(fā)酵液中主要香氣物質(zhì)為：乙酸乙酯(16.70%)、丙酸乙酯(11.31%)、丁酸乙酯(7.47%)、2-丁稀酸乙酯(5.01%)、丙酸異丁酯(4.50%)、丙酸-2-甲基丁酯(3.79%)、2-甲基-2-丁烯酸乙酯(3.66%)、乙酸-2-甲基丙酯(2.59%)、己酸乙酯(2.31%)以及苯乙醇(3.95%)、3-甲基丁醇(5.93%)。這些香氣物質(zhì)含量占總量的67.22%。由此可見，主要香氣成分為酯類和醇類。這也是該菌發(fā)酵液散發(fā)出濃郁水果香味的重要原因。

本次測定得到的46種香氣成分中，乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、3-甲硫基丙酸乙酯等化合物常出現(xiàn)在香蕉、菠蘿、草莓等果品的香氣成分中。苯乙醇是一種具有花香的液體，它具有柔和、愉快而持久的玫瑰香味從而被廣泛應用于各種食用香精和煙用香精中。

3 討 論

從果園的泥土中篩選得到的地霉屬菌株，生長條件簡單，可以利用工業(yè)上的廢料解決環(huán)境污染問題[12-13]，生長速度快、周期短、成本低，在工業(yè)上應用十分廣泛。發(fā)酵12h后能夠產(chǎn)生紅色色素，24h后能夠產(chǎn)生天然的香蕉、菠蘿等香味，這在其他資料上也有報道[14]。

菌發(fā)酵液感官特征由芳香成分的種類、含量、感官閾值及各成分間的相互作用所決定。由于芳香物質(zhì)易于揮發(fā)，同時菌的生長受到各種條件的影響，使得菌發(fā)酵液芳香物質(zhì)的生物合成過程受到不同程度的影響，可導致部分香氣成分難以定性，但是主要的香氣成分是穩(wěn)定的，是能夠測量的。本次測定的菌發(fā)酵液香氣總含量已經(jīng)占總峰值的88.11%，包括酯類、醇類、醛類、萜類、芳香烴類等成分，這些成分都具有濃厚的水果型香味。

通過從發(fā)酵液中提純所得到的酯類混合物所散發(fā)出的香味是天然合成的復合香味，這是人工化學合成方法很難合成出來。運用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀的手段確定菌發(fā)酵液芳香物質(zhì)組分以及含量為下一步在實踐中應用提供了科學依據(jù)。該菌株所具有的增香、增色功能，可以應用到醬油、醋等調(diào)味品的生產(chǎn)中，同時可以作為食品添加劑等，應用到食品工業(yè)的許多方面，具有潛在經(jīng)濟價值。值得注意的是在混合物中有一種化合物含有硫元素，它是否在菌發(fā)酵液中起到重要作用，有待于進一步實驗證實。

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Preliminary Identification and Aroma Component Analysis in an Aroma-producing Strain

LI Feng，MING Yan-hong，LI Yuan-yuan，PAN Yao，CHEN Qi
(Anhui Key Laboratory of Plant Resources and Biology, College of Life Sciences, Huaibei Coal Industry Teacher’s College, Huaibei 235000, China)

An aroma-producing strain was isolated and purified from soil samples collected from Dangshan Anhui province in China and prliminarily identified as Geotrichum based on morphological characteristivs. Hs-S-SPME and GC-MS results indicated that major aroma components were esters and alcohols. The esters exhibited the highest content, which were about 32 species and accounted for 73.84%. In addition, the alcohols were 8 species, which were accounted for 12.53%.

fruity aroma-producing strain；growth curve；aroma components；GC-MS

Q93.331

A

1002-6630(2010)09-0219-05

2010-02-03

安徽高校省級自然科學研究重點項目(KJ2008A086)

李峰(1970—)，男，副教授，博士，主要從事微生物生理、發(fā)酵和分子遺傳學研究。E-mail：rx2500@163.com