梁紅寶，郭 葳，董聲雄，伍久林，彭臻菲，劉志彬，張其清,2,*

(1.福州大學(xué)生物和醫(yī)藥技術(shù)研究院，福建 福州 350002；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所，天津 300192)

鮑魚殼水溶性基質(zhì)抗氧化活性研究

梁紅寶1，郭 葳1，董聲雄1，伍久林1，彭臻菲1，劉志彬1，張其清1,2,*

(1.福州大學(xué)生物和醫(yī)藥技術(shù)研究院，福建 福州 350002；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所，天津 300192)

考察鮑魚殼水溶性基質(zhì)(WSMA)抗氧化活性。利用DEAE-Sephadex A-25離子交換層析法(IEC)對(duì)WSMA進(jìn)行純化。以珍珠水溶性基質(zhì)(WSMP)及VC為對(duì)照，通過對(duì)二苯代苦味肼基自由基(DPPH·)、羥自由基(·OH)、超氧陰離子自由基(O2·)的清除能力和Fe3+還原能力的研究考察其抗氧化作用。結(jié)果表明，WSMA與WSMP具有相似的Fe3+還原能力和O2·清除能力，而對(duì)DPPH·和·OH無(wú)清除作用。通過IEC純化得到的AⅡ組分為主要活性成分，當(dāng)質(zhì)量濃度為1.0mg/mL時(shí)，對(duì)O2·清除率達(dá)80%，與0.1mg/mL的VC相當(dāng)。

鮑魚殼；水溶性基質(zhì)；抗氧化性；離子交換層析

鮑魚(abalone)屬于軟體動(dòng)物，雙殼綱，其殼由角質(zhì)層、棱柱層、珍珠層組成，由95%的CaCO3和0.3%～5%的有機(jī)基質(zhì)構(gòu)成，有機(jī)基質(zhì)主要存在于珍珠層。其水溶性有機(jī)基質(zhì)含量約為0.03%～0.5%，由糖蛋白、磷蛋白、蛋白聚糖和黏多糖及一些簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)組成的異相混合物約占60%以上[1]。

在人體細(xì)胞代謝過程中，由于有氧的參與而產(chǎn)生一些活性氧(ROS)，主要包括自由基，如超氧陰離子自由基(O2·)、羥自由基(·OH)；一些非自由基，如H2O2、1O2[2]。ROS能夠引起細(xì)胞膜磷脂成分的過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致H2O2的積聚，而H2O2很不穩(wěn)定，容易產(chǎn)生·OH和1O2；ROS也能破壞一些非常重要的生物大分子，如：核酸、蛋白和多糖等，如果不能及時(shí)清除ROS，則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的老化、死亡[3]。近年來，一些人工合成抗氧化劑已經(jīng)應(yīng)用到食品中輔助清除人體過量自由基，但是，由于合成抗氧化劑長(zhǎng)期使用的安全性已經(jīng)受到質(zhì)疑，人們迫切需要天然無(wú)毒抗氧化劑的出現(xiàn)。

據(jù)文獻(xiàn)[4]報(bào)道，珍珠水提取液能顯著提高小鼠體內(nèi)SOD活性和降低過氧化產(chǎn)物(MDA)的水平，有良好的鎮(zhèn)靜、養(yǎng)陰和抗氧化作用；珍珠層粉水解液能較好地清除超氧自由基[5-6]。近年來，由于珍珠價(jià)格的不斷攀升，而貝殼珍珠層與珍珠具有非常相似的成分，因此人們把目標(biāo)投向了用廢棄的貝殼開發(fā)珍珠層粉。但是，由于珍珠層位于貝殼的最內(nèi)層，而且很薄，利用物理或化學(xué)方法提取，不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且很容易破壞所含的有機(jī)基質(zhì)生物活性。因此，為了充分利用貝殼資源，本實(shí)驗(yàn)直接從貝殼粉中提取水溶性基質(zhì)，并通過對(duì)二苯代苦味肼基自由基(DPPH·)、·OH、O2·3種自由基

的清除作用和Fe3+的還原能力來考察鮑魚殼水溶性基質(zhì)的抗氧化活性，以尋找天然的高效抗氧化劑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai) 福建誼來鮑魚制品有限公司；珍珠(pearl) 廣西北海市鐵山港區(qū)海瑞珍珠制品廠。

二苯代苦味肼基自由基(DPPH·) Alfa Aesar公司；黃嘌呤、黃嘌呤氧化酶 Roche公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV 1600紫外-可見光分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；TGL-16C臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；RE-5210濃縮儀 上海亞榮生化儀器廠；SF-130C粉碎機(jī) 中國(guó)吉首市中城制藥機(jī)械廠；電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；離子交換層析裝置、RP-HPLC 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

將鮑魚殼沖洗干凈自然晾干后，用粉碎機(jī)粉碎成80～120目的粉末。稱取100g粉末放入200mL蒸餾水中，4℃攪拌溶解24h，取出混合液，殘?jiān)儆盟崛纱魏蠛喜⒌交旌弦豪铮^濾后，4℃條件下以12000r/min離心20min，上清液即為鮑魚殼水溶性基質(zhì)(WSMA)。

同法制備珍珠水溶性基質(zhì)(WSMP)。

1.3.2 DPPH·體系中抗氧化活性測(cè)定

[7]的方法：試管中依次加入：0.2mL樣品溶液，1.8mL蒸餾水，2.0mL 2.0×10-4mol/L DPPH溶液，混合均勻后在室溫下避光反應(yīng)30min。在517nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度；空白為以等體積無(wú)水乙醇代替DPPH·溶液；對(duì)照為以等體積蒸餾水代替樣品溶液。DPPH·清除率依據(jù)公式(1)計(jì)算。

式中：Ax為加入樣品后溶液的吸光度；Ax0為樣品溶液本身的吸光度；A0為未加樣品溶液的吸光度。

1.3.3 ·OH體系中抗氧化活性測(cè)定

參考文獻(xiàn)[8]的方法：在試管中依次加入1.0mL 9.0mmol/L FeSO4，1.0mL 9.0mmol/L水楊酸-乙醇溶液，0.2mL樣品溶液，1.0mL 8.8mmol/L H2O2，每加入1種試劑都要充分混勻，置于37℃水浴中保溫45min，冷卻至室溫，于波長(zhǎng)510nm處測(cè)吸光度?！H清除率按照式(1)方法計(jì)算。

1.3.4 O2·體系中抗氧化活性測(cè)定

參考文獻(xiàn)[9]的方法：在試管中依次加入1.0mL 75mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.8)，待測(cè)樣品0.2mL，0.1mol/L鹽酸羥胺溶液0.1mL，75mmol/L黃嘌呤氫氧化鈉溶液0.1mL，0.1U/mL黃嘌呤氧化酶0.1mL，搖勻后置于37℃水浴30min，加入2.0mL顯色劑，靜置10min后于530nm處測(cè)定吸光度。O2·清除率根據(jù)式(2)計(jì)算。

式中：Ai為加入抗氧化劑后的吸光度；A0為未加入抗氧化劑時(shí)的吸光度。

1.3.5 Fe3+還原能力測(cè)定

采用FRAP的方法測(cè)定Fe3+還原能力[7]：將200μL樣品液同1.0 mL三價(jià)鐵還原抗氧化能力測(cè)試工作液(FRAP) (0.2mol/L，pH3.6乙酸鈉緩沖液、10mmol/L TPTZ和20mmol/L 三氯化鐵以體積比10∶1∶1混合)混合，37℃反應(yīng)10min，在593nm處測(cè)定吸光度。繪制樣品- FeSO4質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以直線斜率表示還原能力的相對(duì)大小。

1.3.6 離子交換層析(IEC)分離

取100mL經(jīng)過1kD透析袋透析后的WSMA上樣于DEAE-Sephadex A-25離子交換層析柱。洗脫條件為：0～0.6mol/L NaCl 20mmol/L Tris-HCl(pH8.0)緩沖液120mL線性梯度洗脫，接著用2.0mol/L NaCl溶液洗脫，流速為1.0 mL/mi n，紫外檢測(cè)2 8 0 n m波長(zhǎng)處的光密度(OD280nm)，自動(dòng)收集器每管3mL收集洗脫液，并冷凍干燥，貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.7 活性組分主要成分分析

利用Bradford法[10]進(jìn)行蛋白含量測(cè)定，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)物，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=10.63X+0.0252，R2= 0.9907。利用苯酚-硫酸法[11]進(jìn)行多糖含量測(cè)定，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)物，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=17.206X+0.0154，R2＝0.9934。

2 結(jié)果與分析

2.1 WSMA自由基清除率測(cè)定結(jié)果

由圖1可見，質(zhì)量濃度為0.1、1.0、10mg/mL的WSMA對(duì)DPPH·和·OH的清除率都在5%以下，甚至出現(xiàn)負(fù)值，說明WSMA中可能存在一些具有氧化性的物質(zhì)，而起到相反的作用。WSMA對(duì)O2·的清除率則從9.29%提高到50.02%。由此可見，WSMA的抗氧化性較強(qiáng)，且主要表現(xiàn)為清除O2·活性。當(dāng)質(zhì)量濃度為1.0mg/mL時(shí)，WSMA對(duì)O2·的清除率約為30%。

圖1 不同質(zhì)量濃度的WSMA對(duì)DPPH·、·OH和O2·的清除作用Fig.1 Scavenging capabilities of WSMA at various concentrations to DPPH·,·OH an d O2·

2.2 WSMA的IEC層析及對(duì)O2·清除能力測(cè)定

圖2 WSMA在不同NaCl濃度下的洗脫曲線Fig.2 Elution profiles of WSMA at different salt concentrations

由圖2可見，通過對(duì)WSMA進(jìn)行離子交換分離，先用濃度為0～0.6mol/L NaCl溶液進(jìn)行線性洗脫，可以得到一個(gè)比較寬的鐘形峰，命名為AⅠ；再用2.0mol/L NaCl溶液洗脫，洗至無(wú)紫外吸收時(shí)，收集得到一個(gè)比較強(qiáng)的尖峰，命名為AⅡ。分別收集合并AⅠ、AⅡ峰尖部分洗脫液，進(jìn)行O2·清除率測(cè)定。

圖3 AⅠ與AⅡ組分對(duì)O2·的清除作用Fig.3 Scavenging effects of AⅠ and AⅡ on O2·

由圖3可知，組分AⅠ基本沒有抗氧化活性，組分AⅡ具有較好的活性，對(duì)O2·清除率達(dá)到60%左右，因此，經(jīng)過純化的AⅡ?yàn)閃SMA的主要抗氧化作用組分。2.3WSMP、WSMA和AⅡ?qū)e3+的還原能力測(cè)定結(jié)果

由圖4可知，F(xiàn)eSO4質(zhì)量濃度在0～0.5mg/mL時(shí)，線性關(guān)系良好，回歸方程Y＝2.1237X＋0.0072，R2＝0.9999。在0～1.0mg/mL范圍內(nèi)，不同質(zhì)量濃度樣品對(duì)應(yīng)FeSO4的質(zhì)量濃度線性關(guān)系良好。WSMP、WSMA、AⅡ相應(yīng)的回歸直線的斜率分別為：0.037、0.047、0.11，可見AⅡ具有最強(qiáng)的還原能力，而WSMP 和WSMA則相對(duì)較弱。

圖4 WSMA、AⅡ、WSMP對(duì)Fe3+的還原能力Fig.4 Reducing power of WSMA, AⅡ and WSMP to Fe3+

2.4 WSMP、WSMA和AⅡ?qū)2·清除能力的測(cè)定

圖5 WSMA、WSMP、AⅡ與VC對(duì)O2·的清除率Fig.5 Scavenging effects of WSMA, WSMP, AⅡ and vitamin C on O2·

由圖5可以看出，在0.01～1.0mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，WSMP、WSMA對(duì)O2·具有相似的清除效果，尤其在質(zhì)量濃度小于0.5mg/mL時(shí)，二者的清除率-質(zhì)量濃度曲線基本重合。而組分AⅡ與WSMA、WSMP相比，清除率提高了1～1.5倍。質(zhì)量濃度為1.0mg/mL的WSMP、WSMA對(duì)O2·清除率分別為39%和30%，而AⅡ則高達(dá)80%，與0.1mg/mL的VC清除能力相當(dāng)。

此外，在0～1.0mg/mL范圍內(nèi)，WSMA、WSMP與AⅡ?qū)2·的清除率隨著樣品質(zhì)量濃度的增大而增大，基本呈線性變化，表明三者的作用方式可能相同，而VC的作用曲線在0～0.1mg/mL范圍內(nèi)線性增大，此后速率不再隨樣品質(zhì)量濃度變化而改變，與它們模式不盡相同，因而它們作用方式可能存在區(qū)別。O2·清除作用的機(jī)理一般有3種：1)抗氧化劑可以結(jié)合O2·形成一種更穩(wěn)定的自由基而終止反應(yīng)；2)抗氧化劑可能直接淬滅O2·；3)抗氧化劑可能干擾黃嘌呤氧化酶的活性，從而根本上消除了自由基的產(chǎn)生。對(duì)WSMA、WSMP與AⅡ?qū)2·的清除機(jī)理還需要進(jìn)一步研究。

2.5WSMA和AⅡ蛋白和多糖含量的測(cè)定

表1 WSMA和AⅡ的蛋白和多糖含量的測(cè)定結(jié)果Table 1 Determination of proteins and polysaccharides in WSMA and AⅡ

由表1可知，WSMA中蛋白和多糖含量較低，而經(jīng)過純化后得到的AⅡ蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高約10倍，達(dá)到3.5%，多糖含量也由1.3%提高到9.0%。由WSMA和AⅡ的外觀來看，二者很可能都含有一些色素類物質(zhì)，并且AⅡ中含量更高。與WSMA相比，AⅡ的蛋白、多糖、色素含量都明顯增加，而抗氧化活性也隨之增大，因此，可以推斷它們可能對(duì)抗氧化活性都具有一定貢獻(xiàn)。

由于鮑魚殼成分復(fù)雜，僅僅通過透析和離子交換層析很難制得純組分，許多研究[12-14]也證明了這一點(diǎn)。對(duì)AⅡ的進(jìn)一步的分離純化還有待下一步研究。

3 結(jié) 論

WSMA與WSMP相似，具有較好的Fe3+還原能力和O2·清除能力，而對(duì)DPPH·和·OH無(wú)清除作用。WSMA通過IEC純化得到AII組分為主要活性成分，當(dāng)質(zhì)量濃度為1.0mg/mL時(shí)，對(duì)O2·清除率達(dá)80%，與0.1mg/mL的VC相當(dāng)。AⅡ組分成分復(fù)雜，含有蛋白、多糖、色素等物質(zhì)，都可能具有抗氧化活性，對(duì)它的進(jìn)一步分離純化工作還在進(jìn)行。

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Antioxidant Activity of Water-soluble Matrix from Abalone Shell

LIANG Hong-bao1，GUO Wei1，DONG Sheng-xiong1，WU Jiu-lin1，PENG Zhen-fei1，LIU Zhi-bin1，ZHANG Qi-qing1,2,*
(1. Institute of Biomedical and Pharmaceutical Technology, Fuzhou University, Fuzhou 350002, China；2. Institute of Biomedical Engineering, Chinese Academy of Medical Sciences, Tianjin 300192, China)

The water-soluble matrix from abalone shell (WSMA) was purified by ion exchange chromatography (IEC) in DEAESephadex A-25 column. The antioxidant activity of WSMA was evaluated by scavenging capabilities of DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazy), hydroxyl (·OH) and superoxide anion (O2·) free radicals, and reducing powder of ferric ions. Compared with water-soluble matrix from pearl (WSMP) and vitamin C, WSMA revealed the similar reducing power and scavenging capability to O2· with WSMP, however, both WSMA and WSMP exhibited a weak inhibition effect on DPPH· and ·OH. The fraction from the second peak (AⅡ) separated by IEC was the major bioactive component. The scavenging capability of 1.0 mg/mL AⅡ to superoxide anion free radicals was 80%, which was equivalent to 0.1 mg/mL vitamin C.

abalone shell；water-soluble matrix；antioxidant activity；ion exchange chromatography

TS254.4

A

1002-6630(2010)09-0113-04

2009-09-07

梁紅寶(1985—)，男，碩士研究生，主要從事功能高分子研究。E-mail：ruby-boy@tom.com

*通信作者：張其清(1954—)，男，教授，博士，主要從事生物醫(yī)學(xué)工程研究。E-mail：zhangqiq@126.com