宋曉昕

結(jié)腸癌是一種常見的惡性腫瘤，我國結(jié)腸癌發(fā)病率和死亡率有逐年增加的趨勢。侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致結(jié)腸癌患者臨床治療失敗和死亡的主要原因之一。目前認(rèn)為腫瘤轉(zhuǎn)移是一種主動過程，需要腫瘤細(xì)胞運動，從原發(fā)灶脫離，穿破結(jié)締組織構(gòu)成的基底膜及血管淋巴管壁的機械屏障，進入體液循環(huán)，最后再次穿透血管淋巴管壁在靶器官定位，并在該處擴增成轉(zhuǎn)移灶，可基本概括為癌組織在浸潤轉(zhuǎn)移前進行細(xì)胞自身的粘附解除;癌細(xì)胞粘附于基質(zhì);癌細(xì)胞釋放蛋白水解酶降解基質(zhì)(ECM);癌細(xì)胞的移行等。Liotta等［1］將此概括為腫瘤細(xì)胞浸潤轉(zhuǎn)移的3步假說，即粘附、降解和移動。雖然腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是多基因參與、多步驟完成的復(fù)雜過程，但是腫瘤細(xì)胞間粘附減弱和腫瘤細(xì)胞運動能力增強無疑是腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測Fascin、β-連接素(βcatenin)、上皮鈣黏附素(E-cadherin)蛋白在正常大腸黏膜、大腸腺瘤、大腸腺瘤惡變和大腸癌中的表達(dá)及其關(guān)系，以探討Fascin、β-連接素(β-catenin)、上皮鈣黏附素(E-cadherin)在大腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本采集:50例大腸腺瘤取自2003年1月至2008年12月我院內(nèi)鏡活檢標(biāo)本，其中輕度異型增生19例，中、重度異型增生31例。大腸腺瘤癌變病例30例及大腸癌40例取自同期我院手術(shù)切除標(biāo)本作為研究對象，同時以大腸黏膜20例作為對照(均取腸癌標(biāo)本距腫物10 cm以上的大腸黏膜)。本組研究病例中，男63例，女57例;年齡22～81歲，平均年齡56.1歲;55歲以下43例，55歲以上77例。40例大腸癌中，浸潤深度未侵及漿膜13例，侵及漿膜27例;無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16例;Dukes分期A+B期24例，C+D期16例，高-中分化29例，低-未分化11例。所有病例全部切片均由兩位高年資病理醫(yī)師嚴(yán)格按照2000年WHO標(biāo)準(zhǔn)［2］進行明確診斷復(fù)核。所有標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片。

1.1.2 試劑:鼠抗人 Fascin、E-cadherin、β-catenin 單克隆抗體，通用型SP檢測試劑盒和DAB酶底物顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2 方法 免疫組織化學(xué)按免疫組織化學(xué)增強型試劑盒說明書進行，每批染色均設(shè)陰、陽性對照，即以PBS替代一抗作為陰性試劑對照，以試劑說明書中推薦的組織切片為陽性組織對照。最佳一抗稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)是能得到最大的抗原染色強度和最低的背景染色。免疫組化標(biāo)記采用SP法，抗原修復(fù)采用檸檬酸鹽緩沖液中加熱，保持92～98℃ 15 min，室溫下自然冷卻。DAB顯色。

1.3 染色結(jié)果判斷 Fascin蛋白陽性產(chǎn)物主要定位于細(xì)胞漿，表現(xiàn)為胞漿內(nèi)有棕黃色顆粒。在間質(zhì)中高表達(dá)，因此，在間質(zhì)中的表達(dá)可以作為內(nèi)對照。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果采用以下判斷標(biāo)準(zhǔn)［3］。將染色程度評分:無色記0分、淡黃色記1分、棕黃色記2分和棕褐色記3分;再將陽性細(xì)胞所占的百分比評分:0分為陰性、陽性細(xì)胞數(shù)≤10%記1分、11% ～50%記2分、51%～75%記3分、＞75%記4分，然后計算兩者的乘積。乘積＜3分為陰性，≥3分為陽性。E-cadherin、β-catenin主要表達(dá)于正常黏膜上皮的細(xì)胞膜上，在相鄰的細(xì)胞間隙呈連續(xù)點狀或同質(zhì)線狀分布，以細(xì)胞膜為陽性表達(dá)部位作為陽性對照。β-catenin染色結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)按照Maruyama等［4］方法，細(xì)胞膜陽性表達(dá)＞70%為正常表達(dá);細(xì)胞膜陽性表達(dá)＜70%為表達(dá)缺失;細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核＞10%陽性為胞質(zhì)或胞核陽性表達(dá);胞質(zhì)或胞核表達(dá)稱為異位表達(dá);細(xì)胞膜表達(dá)缺失、胞質(zhì)或胞核表達(dá)統(tǒng)稱為表達(dá)異常。E-cadherin染色結(jié)果以癌細(xì)胞細(xì)胞膜陽性表達(dá)＞70%為正常表達(dá)，＜70%為表達(dá)缺失。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料采用用χ2檢驗，F(xiàn)isher確切概率計算法及相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三種蛋白在不同大腸組織中的表達(dá) fascin蛋白標(biāo)記定位在癌細(xì)胞的胞質(zhì)中，呈棕黃色顆粒狀，β-catenin、E-cadherin正常表達(dá)定位于上皮細(xì)胞膜，大腸腺瘤、大腸腺瘤惡變和大腸癌組織β-catenin、E-cadherin胞膜表達(dá)不同程度缺失，β-catenin呈胞漿和(或)胞核異位表達(dá)。正常大腸黏膜組織、大腸腺瘤、大腸腺瘤惡變、大腸癌組織中fascin、β-catenin、E-cadherin的表達(dá)情況。見表1。

表1 fascin、β-catenin、E-cadherin蛋白在不同大腸組織中的表達(dá)例(%)

2.2 fascin、β-catenin、E-cadherin蛋白表達(dá)與大腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 見表2。

表2 Fascin、β-catenin、E-cadherin 蛋白表達(dá)與大腸癌中臨床病理因素的相關(guān)性 例(%)

2.3 fascin、β-catenin、E-cadherin蛋白在大腸癌中表達(dá)的相關(guān)性 Fascin陽性表達(dá)與β-catenin異位表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.711，P ＜0.01);Fascin陽性表達(dá)與E-cadherin膜表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r= －0.803，P ＜0.01);β-catenin膜表達(dá) E-cadherin膜表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.849，P ＜0.01)。見表 3。

表3 大腸癌中Fascin、β-catenin、E-cadherin 蛋白表達(dá)的相關(guān)性例

3 討論

侵襲、轉(zhuǎn)移行為是惡性腫瘤的本質(zhì)特性。腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的起始步驟是細(xì)胞向遷移的方向伸出突起［5］。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的運動是由actin的組裝狀態(tài)所驅(qū)動的，細(xì)胞通過組裝actin纖維分支網(wǎng)絡(luò)而形成運動前緣的細(xì)胞突起［6］。人類fascin-1基因?qū)儆趂ascin家族，其基因編碼產(chǎn)物是一種細(xì)胞骨架蛋白，可與F-actin結(jié)合，又稱為actin束蛋白，定位于細(xì)胞質(zhì)應(yīng)力纖維 (stressfibers)、細(xì)胞膜皺褶 (membraneruffies)邊緣的絲狀偽足(filopodia)、微刺(mierospikes)的核心actin束中，在細(xì)胞遷移時集中于細(xì)胞前緣的突起［7］。Fascin蛋白在正常上皮細(xì)胞中不表達(dá)或低表達(dá)，但在一些上皮組織腫瘤中常表達(dá)上調(diào)。fascin的過度表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞間粘著力降低和細(xì)胞運動活性增加。

E-cadherin/β-catenin復(fù)合體是介導(dǎo)同型細(xì)胞間粘附的連接復(fù)合體，其在維持正常上皮的極性和完整性中起重要作用，腫瘤細(xì)胞間粘附的喪失是腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。

Catenins是第一個具有連接細(xì)胞-細(xì)胞黏附分子cadherin的細(xì)胞質(zhì)區(qū)至actin骨架蛋白特征的分子，它的基本作用是調(diào)整cadherin的黏附性。而fascin將actin細(xì)絲束縛至β-catenin的中央Armadillo重復(fù)區(qū)，fascin and E-cadherin與β-catenin結(jié)合利用相似的結(jié)合位點，形成互助的復(fù)合體。fascin and E-cadherin局限于細(xì)胞-細(xì)胞邊緣及動態(tài)細(xì)胞如上皮和內(nèi)皮細(xì)胞的前沿。β-catenin可能參與fascin聯(lián)合調(diào)整細(xì)胞骨架動力學(xué)［8］。

本研究結(jié)果表明Fascin/E-cadherin、β-catenin蛋白在大腸黏膜—腺瘤—腺瘤癌變—癌序列中的胞漿/胞膜陽性表達(dá)呈逐步增強/減弱趨勢，β-catenin異位表達(dá)逐步增強。Fascin/E-cadherin、β-catenin在結(jié)直腸癌組織中的陽性表達(dá)明顯高于/低于正常黏膜及腺瘤組織中的表達(dá)(P＜0.05);Fascin陽性表達(dá)與β-catenin異位表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.711，P ＜0.01)，F(xiàn)ascin 陽性表達(dá)與 E-cadherin膜表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=－0.803，P ＜0.01)，β-catenin膜表達(dá) E-cadherin膜表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.849，P ＜0.01)。本研究對 fascin、E-cadherin、β-catenin 蛋白在結(jié)、直腸癌組織中表達(dá)的臨床病理意義進行比較分析，結(jié)果表明，隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生、腫瘤侵潤深度不斷增加，組織學(xué)分級的增高及臨床分期的進展，fascin/E-cadherin、β-catenin蛋白的陽性表達(dá)率均明顯增高/減低(P＜0.05)。而與患者的年齡、性別無關(guān)(P＞0.05)。提示Fascin陽性表達(dá)的腫瘤往往有較高的組織學(xué)分級或者較高的侵襲性。E-cadherin/β-catenin復(fù)合體黏附特性的改變也可能導(dǎo)致細(xì)胞骨架的重排。從而促進腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移。

研究發(fā)現(xiàn)，正常膽管上皮細(xì)胞不表達(dá)fascin而在癌細(xì)胞中經(jīng)常有陽性表達(dá)［9］。侵襲性腫瘤細(xì)胞大量地表達(dá)fascin，在腫瘤侵襲的前沿較其他區(qū)域更為常見。并且還發(fā)現(xiàn)增強fascin的免疫反應(yīng)性有干擾E-cadherin和β-catenin的膜的免疫反應(yīng)性。在fascin過表達(dá)的腫瘤細(xì)胞中E-cadherin和betacatenin在膜上的表達(dá)減低。還有研究者認(rèn)為在結(jié)直腸癌中fascin表達(dá)可能受wnt途徑的調(diào)節(jié)［4］，導(dǎo)致fascin蛋白的異常表達(dá)，提高了細(xì)胞運動能力和移動性，促使細(xì)胞產(chǎn)生各種惡性行為。而最近對結(jié)腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)，fascin是β-catenin-TCF信號通路的新靶點之一。Fascin、β-catenin、E-cadherin聯(lián)合應(yīng)用有可能作為一種判斷預(yù)后的指標(biāo)，從而早期識別那些具有高度侵襲和轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤。而且fascin也很有可能成為一個新的基因治療靶點。

1 Liotta LA，Mandler R，Murano G，et al.Tumor cell autocrine motiling factor.Proc Natl Acid Sci USA，1986，83:3302-3306.

2 WHO.腫瘤國際組織學(xué)新分類-腸道腫瘤組織學(xué)分型.診斷病理學(xué)雜志社，2000.12.

3 許良中，楊文濤.免疫組織化學(xué)反應(yīng)結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn).中國癌癥雜志，1996，6:229-231.

4 Maruyama K，Ochiai A，Akimoto S，et al.Cyoplasmic beta-catenin Accumulation as a Predictor of hematogenous metastamis in human coldrectal.Caneer.Oncology，2000，59:302-309.

5 Friedl P，Wolf K.Tumour-cell invasion and migration:diversity and escap mechanisms.Nat Rev Cancer，2003，3:362-372.

6 Pollard TD，Borisy GG.Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments.Cell，2003，112:453-65.

7 Yamashiro-Matsumura S，Matsumura F.Intracellular localization of the 55-kD Actin-bundling Protein in cultured cells:spatial relationships with actin，alpha-actinin，tropomyosin，and fimbrin.J Cell Biol，1986，103:631-640.

8 Tao YS，Edwards RA，Tubb B，et al.Beta-catenin associates with the actin-bundling protein fascin in a noncadherin complex.J Cell Biol，1996，134:1271-1281.

9 Okada K，Shimura T，Asakawa K，et al.Fascin expression is correlated with tumor progression of extrahepatic bile duct cancer.Hepatogastroenterology，2007，54:17-21.