李樹生,熊建平,曾永明,王維剛,陳少鋒

(汕頭市潮南民生醫(yī)院普外科,廣東 汕頭 515144)

重癥急性胰腺炎(SAP)是一種嚴(yán)重的分解代謝疾病,常由于劇烈的全身炎癥反應(yīng)和全身性感染引起多器官功能障礙(MODS),病死率較高(10%-20%)[1]。研究表明,在創(chuàng)傷、失血、感染等應(yīng)激情況下,糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoid,GC)分泌增多是應(yīng)激的一個(gè)最重要的反應(yīng),對機(jī)體抵抗有害刺激起著極為重要的作用。GC的效應(yīng)不僅取決于其在血漿中的濃度,而且還取決于靶細(xì)胞上糖皮質(zhì)激素受體(Glucocorti-coidreceptor,GR)的數(shù)量和親和力[2]。動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)應(yīng)激時(shí)可發(fā)生 GR的數(shù)量和親和力下降,而 GR又是體內(nèi)重要的炎癥負(fù)調(diào)控因子[3],本試驗(yàn)研究早期大劑量甲基強(qiáng)的松龍沖擊治療大鼠重癥胰腺炎,為糖皮質(zhì)激素治療胰腺炎提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及動物 SPF級雄性 SD大鼠72只,體重(300±50)g,由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供;L-精氨酸由上海生物工程有限公司提供;戊巴比妥鈉由廣州南方化玻璃公司提供;淀粉酶檢測試劑盒,美國 Begman公司生產(chǎn);兔抗大鼠 GR多克隆 IgG抗體(Santa Cruz公司生產(chǎn))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動物分組及動物模型的制作 2009年6月至 2009年 10將 72只 SD大鼠隨機(jī)分成三組(每組 24只,每組又分 6 h、12 h、24 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)):正常對照組(NS組);重癥胰腺炎生理鹽水治療組(SAP組);重癥胰腺炎甲強(qiáng)龍治療組(MES組)。各組術(shù)前 12 h禁食,不禁水。動物 SAP模型是通過腹腔內(nèi)注射 L-精氨酸(320 mg/100 g),L-精氨酸用生理鹽水配置成 20%濃度,第一次注射后間隔 1 h再次以相同計(jì)量腹腔內(nèi)注射一次[4]。NS組將 L-精氨酸換成等量的生理鹽水,方法同 SAP、MES兩組。模型制作前 10 min通過尾靜脈注射藥物,MES組為甲基強(qiáng)的松龍(30 mg/kg),加入 1 ml的生理鹽水尾靜脈注射;SAP組為等量生理鹽水。三組分別在注射藥物后 6 h、12 h、24 h、72 h通過腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉后剖殺大鼠取標(biāo)本進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的采集 模型制作成功,注射藥物后分別于 6 h、12 h、24 h通過腹腔內(nèi)注射 2%戊巴比妥鈉麻醉后心臟取血 2份,每份約 2 ml,等血液凝固,血清析出后,離心分離(3 000 r/min,10 min),放置在 -70℃冰箱凍存,用于血清淀粉酶的檢測。切取胰腺組織,一分為二,其中一半用于濕干比的檢測,另一半再分成兩份,一份用于 GR檢測,另一份用 4%多聚甲醛固定,石蠟包埋后用于胰腺病理學(xué)觀察。

1.2.3 檢測指標(biāo)及方法

1.2.3.1 各組大鼠 -70℃保存的血清于貝克曼 CX9全自動生化儀上檢測血清淀粉酶。

1.2.3.2 濕干比率的檢測。各組大鼠處死后,切取一半胰腺組織在電子天平上稱重,為濕重量;再將切取的胰腺組織于 60℃烘干 24 h,至質(zhì)量不變,計(jì)算濕干比率。

1.2.3.3 采用單盲法,由病理科醫(yī)生在光鏡下觀察胰腺組織病理學(xué)改變。胰腺組織按照 Schmidt鏡下病理評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分[5]:各時(shí)點(diǎn)隨機(jī)選取 5只大鼠的胰腺病理切片,對每只大鼠病理切片進(jìn)行單獨(dú)評分,5只大鼠的平均分?jǐn)?shù)為各時(shí)點(diǎn)大鼠胰腺的最后病理評分。

1.2.3.4 蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western Blotting)檢測胰腺組織內(nèi) GR水平。新鮮組織 100 mg,與冰預(yù)冷的 0.01 mol/LPBS充分洗滌后加入適量RIPA蛋白提取液勻漿后冰上裂解 30 min,適時(shí)振蕩,4℃離心棄去沉淀取上清。行 10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離(恒壓 100 V,15 h)。待電泳完畢后轉(zhuǎn)印 2 h至 PVDF膜,按蛋白 Maker將膜分為 GR(94 kD)和內(nèi)參(43 kD)兩張,室溫下 5%脫脂牛奶中封閉 2 h:(1)含有 GR蛋白條帶的膜加入兔抗大鼠 GR多克隆 IgG一抗(1∶200稀釋),4℃過夜后放入二抗為羊抗兔 IgG(1∶500稀釋)室溫反應(yīng) 2 h;(2)含有內(nèi)參蛋白條帶的膜放入內(nèi)參抗體(1∶3 000)室溫 2 h后分別增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色,X線底片曝光顯影。以顯影條帶的灰度值與內(nèi)參條帶的灰度值的比值表示 GR蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS 13.0進(jìn)行單因數(shù)方差分析和 LSD法兩兩比較。全部數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 血清淀粉酶 SAP組較 NS組在 6 h、12 h、24 h的血清淀粉酶值明顯升高(P＜0.01),MES組較 SAP組在 6 h、12 h、24 h的血清淀粉酶值明顯降低(P＜0.01),詳見表 1。

表1 各組血清淀粉酶活性測定結(jié)果(x±s,U/L)

2.2 胰腺組織濕干比重 SAP組較 NS組在 6 h、12 h、24 h的胰腺濕干比率明顯升高(P＜0.01),MES組較 SAP組在 6 h、12 h、24 h的胰腺濕干比率明顯降低(P＜0.05),見表 2。

表2 各組大鼠胰腺組織濕干比重結(jié)果(x±s)

2.3 胰腺組織病理學(xué)改變及評分 SAP組較NS組在 6 h、12 h、24 h的病理學(xué)評分明顯升高,MES組較 SAP組在 6 h、12 h、24 h的病理學(xué)評分明顯降低(P＜0.01),見表 3。

表3 各組大鼠不同時(shí)相胰腺組織病理學(xué)評分結(jié)果(x±s,分)

2.4 胰腺組織內(nèi) GR受體變化 SAP組較 NS組在 6 h、12 h、24 h的 GR蛋白表達(dá)明顯降低,MES組較 SAP在 6 h、12 h、24 h的 SAP組在 6 h、12 h、24 h的 GR蛋白表達(dá)明顯升高(P＜0.01),見表 4。

表4 各組大鼠胰腺組織內(nèi) GR蛋白表達(dá)變化(x±s)

3 討 論

急性胰腺炎時(shí)多種酶和生物活性物質(zhì)的釋放,使得白細(xì)胞過度激活,引起炎癥介質(zhì)的瀑布樣連鎖反應(yīng)。正是由于多種炎癥介質(zhì)的共同作用,導(dǎo)致急性胰腺炎從局部病變迅速發(fā)展為 SAP這一全身性病變,在胰腺組織大量壞死的同時(shí),并發(fā)全身多個(gè)臟器功能障礙[6]。本實(shí)驗(yàn)我們通過建立了 SAP大鼠模型,觀察到大鼠 SAP早期血清淀粉酶,胰腺濕干比率出現(xiàn)明顯升高,胰腺出現(xiàn)病理損傷,且隨著時(shí)間的延長,炎癥反應(yīng)及胰腺病理損傷明顯加重。

甲基強(qiáng)的松龍屬于糖皮質(zhì)激素類(GC),可以抑制多種炎癥介質(zhì)的基因合成,并可通過增加抗炎蛋白的合成發(fā)揮抑制炎癥介質(zhì)的作用,從而達(dá)到減輕 SIRS程度,提高 SAP大鼠的生存率。GC是通過廣泛分布的細(xì)胞內(nèi)特異性糖皮質(zhì)激素受體(GCR)行使其主要功能,GC-GCR復(fù)合物是體內(nèi)重要的抗炎因子。多種危重病發(fā)生發(fā)展中,由于 GCR蛋白合成減少,應(yīng)激反應(yīng)中內(nèi)源性 GC的升高及 GCR分解的加速等原因,均出現(xiàn) GCR的減少[7]。GCR無備用受體,當(dāng)GCR減少超過 50%時(shí),GC-GCR復(fù)合物效應(yīng)也平行地降低。盡管應(yīng)激反應(yīng)時(shí)內(nèi)源性 GC分泌過多,但由于 GCR的顯著減少或由于炎癥反應(yīng)時(shí)高細(xì)胞因子導(dǎo)致的 GCR抵抗[8],對機(jī)體不足以發(fā)揮正常的 GC-GCR作用。此時(shí)就必須加大 GC的用量以結(jié)合 GCR的全部,使 GCR的作用得到最大程度的利用,充分發(fā)揮 GC-GCR的抗炎作用。研究表明,在 SAP中,機(jī)體在應(yīng)激時(shí)大量炎性介質(zhì)產(chǎn)生可以影響激素受體的表達(dá)和功能,誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活化蛋白 1和核因子 -κB(NF-κB)的過度表達(dá),導(dǎo)致皮質(zhì)激素受體抵抗(Corticosteroid receptor resistance,CRR),使糖皮質(zhì)激素利用障礙[9]。GC是維系生命的重要活性介質(zhì)和機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)的基本組成部分,具有維持循環(huán)功能穩(wěn)定的作用。因此,維持正常的 GR數(shù)量與功能在各種嚴(yán)重應(yīng)激性疾病的治療中發(fā)揮著重要作用。在本實(shí)驗(yàn)中,我們通過腹腔內(nèi)注射 L-精氨酸建立大鼠 SAP模型,結(jié)果可以看出在重癥胰腺炎的早期就出現(xiàn)糖皮質(zhì)激素受體減少,并且隨著炎癥反應(yīng)的加劇,其下降程度進(jìn)一步惡化。早期、大劑量的使用甲基強(qiáng)的松龍沖擊治療后,糖皮質(zhì)激素受體水平明顯提高;同時(shí)也能有效地降低血清淀粉酶、胰腺水腫及胰腺病理損傷。但是,大劑量甲基強(qiáng)的松龍?zhí)岣咛瞧べ|(zhì)激素受體水平的機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)尚未能闡明,我們推測,大劑量的甲基強(qiáng)的松龍沖擊治療后,能有效地減輕糖皮質(zhì)激素受體抵抗作用,恢復(fù)其正常時(shí)的濃度,但確切的機(jī)制有待于今后進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究闡明。

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