張群鋒,黃余良,劉 玨,李梅清,周建斌

南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科衡陽 421001

△男,1974年10月生,碩士,主治醫(yī)師,研究方向:婦科疾病,E-mail:xiaofeng29@163.com

人型支原體(Mycoplasma hominis,Mh)是常見的性傳播疾病病原體。通常情況下,Mh感染沒有明顯的臨床癥狀,但在羊水中具有較高的檢出率[1],目前認(rèn)為其與早產(chǎn)關(guān)系密切[2-3]。絨毛蛻膜中的母體細(xì)胞具有獨(dú)特的免疫學(xué)特性,它能通過多種機(jī)制抑制母體免疫系統(tǒng)對胎兒的排斥反應(yīng)[4-5],同時(shí),絨毛蛻膜對抗原刺激的敏感性較低,能抑制病原體所誘導(dǎo)的宮內(nèi)炎癥。作者對絨毛蛻膜組織中前炎性細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)及分娩的主要啟動(dòng)因子前列腺素2(PGE2)進(jìn)行了檢測,探討Mh是否對絨毛蛻膜組織具有致炎作用。

1 材料與方法

1.1 M h的培養(yǎng)與滅活 Mh于含有體積分?jǐn)?shù)10%小牛血清、酵母浸液的PPLO培養(yǎng)基中,37℃體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下培養(yǎng) 24～48 h,生長至對數(shù)晚期后,14 000 r/m in離心10 min收集沉渣,用無菌PBS重懸浮。濃縮懸浮液的顏色改變單位(CCU)采用雙份 10倍稀釋肉湯加以計(jì)算。剩余菌懸液置于 56℃20 min以滅活Mh。滅活的Mh再次接種于肉湯培養(yǎng)基和瓊脂固體培養(yǎng)基加以驗(yàn)證,經(jīng)驗(yàn)證后將滅活的Mh于-70℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 絨毛蛻膜組織來自5名選擇性剖宮產(chǎn)的健康孕婦,均知情同意。胎盤分娩后,獲取150 cm2的胎膜,用生理鹽水漂洗以去除殘留血液,手工去除羊膜后,用活檢穿孔器將蛻膜組織剪成直徑為6mm的碎片。隨后將所有組織放入 6孔板中,每孔 6塊,加入 4 mL含體積分?jǐn)?shù) 10%胎牛血清、Hepes、β-巰基乙醇、L-谷氨酰胺及慶大霉素的IMDM培養(yǎng)基,于37℃體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下培養(yǎng) 24 h。次日去除培養(yǎng)基,分 5組培養(yǎng),分別加入PPLO培養(yǎng)基(陰性對照組)、終濃度為 102、104、106CCU/m L的Mh濃縮懸浮液(Mh低、中及高濃度組)及5 g/L脂多糖(陽性對照組),0、6、24、36和 48 h后,每孔棄去500μL培養(yǎng)液,加入等體積(終濃度為20mg/L)酮洛芬后,將6孔板連同其內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞置于-70℃保存,用于TNF-α、IL-10及PGE2測定。

1.3 ELISA法檢測TNF-α、IL-10及PGE2刺激結(jié)束后,將 6孔板于 -70℃反復(fù)凍融 2次以充分裂解細(xì)胞,5 000 r/min離心5m in后取上清液(包含細(xì)胞內(nèi)和先前分泌至胞外的總細(xì)胞因子)儲存于-70℃保存。TNF-α、IL-10和PGE2檢測按照晶美公司的ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,對 5組同一時(shí)間點(diǎn)以及同一組不同時(shí)間點(diǎn)人絨毛蛻膜組織TNF-α、IL-10和PGE2檢測結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析,兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

不同濃度Mh作用于絨毛蛻膜組織后,蛻膜組織中TNF-α、IL-10及PGE2水平見表1～3。

表1 TNF-α檢測結(jié)果(n=3) ng/L

表2 IL-10檢測結(jié)果(n=3) ng/L

表3 PGE 2檢測結(jié)果(n=3) ng/L

3 討論

作者從 5例正常婦女胎膜中獲取絨毛蛻膜組織,它主要由母源免疫系統(tǒng)的蛻膜形成細(xì)胞、胎兒的結(jié)締組織及滋養(yǎng)層細(xì)胞組成。蛻膜組織由非單一細(xì)胞系組成,因此能更好地模擬體內(nèi)由多種反應(yīng)性細(xì)胞組成的功能器官,減少混雜因素對實(shí)驗(yàn)的影響。

IL-6是前炎性細(xì)胞因子,常常用作反映宮內(nèi)炎癥的重要指標(biāo)[6],羊水以及胎兒血液中 IL-6增高能在一定程度上預(yù)測早產(chǎn)的發(fā)生。但 IL-6產(chǎn)生時(shí)間較遲,同時(shí)也不具有特異性[7],故此次實(shí)驗(yàn)未將 IL-6作為檢測指標(biāo)。TNF-α主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生并介導(dǎo)前炎性反應(yīng),并且半衰期比較短。抑炎因子 IL-10是TNF-α誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子,也可由炎癥抗原直接誘導(dǎo),它在維持炎癥平衡過程中起十分重要的作用[8]。

作者發(fā)現(xiàn)Mh和脂多糖刺激蛻膜組織后,TNF-α的產(chǎn)生最快,其后為IL-10和PGE2。這與理論上的炎性刺激后細(xì)胞因子的產(chǎn)生順序相同[9]。誘導(dǎo)蛻膜產(chǎn)生炎癥反應(yīng)需要較高濃度的Mh抗原(閾值),但實(shí)驗(yàn)中無法繪制完整的Mh-TNF-α劑量依賴曲線,因?yàn)榕囵B(yǎng)基內(nèi)Mh抗原濃度無法達(dá)到相應(yīng)的要求。

Mh能在羊水中長時(shí)間寄生,并無明顯臨床癥狀,可能與其毒力較低有關(guān)。作者的研究結(jié)果顯示,對于抗炎作用強(qiáng)的蛻膜組織而言,低劑量的 Mh可能并不能誘發(fā)相應(yīng)的炎癥反應(yīng),大劑量的 Mh才能誘導(dǎo)明顯的TNF-α產(chǎn)生。另外可能的原因是Mh誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)機(jī)制可能與其他細(xì)菌有所不同[10]。某些細(xì)菌或抗原從下生殖道到達(dá)子宮后,如果蛻膜組織產(chǎn)生過強(qiáng)的炎癥反應(yīng)對妊娠不利,這可能是蛻膜組織存在刺激閾值且抗炎效應(yīng)是非特異性的原因。

[1]PerniSC,Vardhana S,Korneeva I,et al.Mycop lasmahominis and Ureap lasma urealyticum in midtrimester amniotic fluid:association with amniotic fluid cytokine levels and pregnancy outcome[J].Am J Obstet Gynecol,2004,191 (4):1 382

[2]Novy MJ,Duffy L,Axthelm MK,et al.Multiplex PCR testing detected higher than expected rates of cervicalMycoplasmas, Ureaplasmas,Trichomonas and viral agents in sexually active Australian women[J].Reprod Sci,2009,16(1):56

[3]Wenman WM,Tataryn IV,Joffres MR,et al.The Edmonton Perinatal Infections Group.Demographic,clinical andmicrobiological characteristics ofmaternity patients:a Canadian clinical cohort study[J].Can JInfect Dis,2002,13(5):311

[4]Mellor AL,Munn DH.Immunology at thematernal-fetal interface:lessons for T cell tolerance and suppression[J]. Annu Rev Immunol,2000,18:367

[5]HolstRM,Jacobsson B,Hagberg H,etal.Cervical length in women in preterm labor with intact membranes:relationship to intra-amniotic inflammation/microbial invasion, cervical inflammation and preterm delivery[J].Ultrasound Obstet Gynecol,2006,28(6):768

[6]Maxwell NC,Davies PL,Kotecha S.Antenatal infection and inflammation[J].What's New,2006,19(3):253

[7]Jacobsson B,Mattsby-Baltzer I,Hagberg H.Interleukin-6 and interleukin-8 in cervical and amniotic fluid:relationship tom icrobial invasion of the chorioamniotic membranes [J].BJOG,2005,112(6):719

[8]PararasMV,SkevakiCL,Kafetzis DA.Preterm birth due tomaternal infection:Causative pathogens and modes of prevention [J].Eur JClin Microbiol Infect Dis,2006,25(9):562

[9]Figueroa R,Garry D,Elimian A,et al.Evaluation of amniotic fluid cytokines in p reterm labor and intactmembranes [J].JMatern Fetal Neonatal Med,2005,18(4):241

[10]Peltier MR,Freeman AJ,Mu HH,et al.Characterization and partial purification of a macrophage-stimulating factor from Mycop lasma hominis[J].Am J Reprod Immunol, 2005,54(6):342