高慧艷,李春陽,蘇曉東,尚平平,陳小玉#

1)鄭州大學公共衛(wèi)生學院衛(wèi)生毒理學教研室鄭州 450001 2)鄭州煙草研究院鄭州 450001

#通訊作者,女,1957年11月生,碩士,教授,研究方向:生殖與發(fā)育毒理,E-mail:chen-xiaoyu@zzu.edu.cn

錳是人體的一種必需微量元素,但是過量的錳可對人的神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)產(chǎn)生毒害作用。過去人們對錳毒性的研究多集中在神經(jīng)系統(tǒng)方面,近年來隨著生殖毒理、生殖流行病學和生殖生化領(lǐng)域研究的發(fā)展,錳對雄性生殖系統(tǒng)的損害日益受到關(guān)注。研究[1-2]顯示,錳對多種雄性動物生殖系統(tǒng)有損害作用。作者觀察了氯化錳對大鼠體外培養(yǎng)的睪丸間質(zhì)細胞(leydig細胞)睪酮合成的影響及氯化錳對雄激素依賴組織、血清睪酮(testosterone,T)和前列腺特異抗原(prostate specific antigen,PSA)水平的影響,以觀察錳的抗雄激素樣作用。

1 材料與方法

1.1 材料 ①動物:成年雄性健康SD大鼠,體質(zhì)量(220±20)g,由河南省實驗動物中心提供,許可證號:SCXK(豫)2005-0001,動物級別二級。②主要試劑:氯化錳(分析純),天津瑞金特化學品有限公司提供;氟他胺,江蘇天士力帝益藥業(yè)有限公司提供;丙酸睪酮(TP)注射液,上海通用藥業(yè)股份有限公司提供;F12培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、臺盼藍以及Ⅱ型膠原酶均購于Sigma公司;人絨毛膜促性腺激素(HCG)購于上海第一生化藥業(yè)公司;Percoll分離液購于Phanacia公司;T檢測試劑盒購于北京北方生物技術(shù)研究所;125I-PSA免疫放射分析試劑盒購于北京科美東雅生物技術(shù)有限公司。

1.2 leydig細胞的分離及純化 參照文獻[3-4]的方法,并適當改進。

1.3 不同濃度的氯化錳對leydig細胞存活率的影響 用DMEM/F12培養(yǎng)基將leydig細胞密度調(diào)整至1.0×105mL-1,接種于24孔板,培養(yǎng) 24 h后,更換為含 1.0×10-6、2.5×10-6、5.0×10-6、1.0× 10-5、2.5×10-5、5.0×10-5和 1.0×10-4mol/L氯化錳的培養(yǎng)基,每個劑量設(shè) 6個復(fù)孔,并設(shè)對照組,繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后,臺盼藍染色計算細胞存活率。實驗重復(fù)3次。

1.4 基礎(chǔ)狀態(tài)和HCG刺激下氯化錳對leydig細胞T分泌的影響 leydig細胞接種于24孔板培養(yǎng)24 h后,分別更換為加和不加10.0 kU/L HCG的含1.0×10-6、2.5×10-6、5.0×10-6、1.0×10-5、2.5× 10-5、5.0×10-5與1.0×10-4mol/L氯化錳的培養(yǎng)基,每個劑量設(shè) 6個復(fù)孔,并設(shè)對照組,繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后,采用放射免疫法測定 T含量。實驗重復(fù)3次。

1.5 各組去勢大鼠血清T與PSA水平及雄激素依賴組織臟器系數(shù)測定 SD大鼠適應(yīng)實驗環(huán)境 1周后,腹腔注射20 g/L戊巴比妥鈉,麻醉完全后行睪丸摘除術(shù),7 d后隨機分為6組(每組10只):溶劑對照組皮下注射玉米油0.2m L;陰性對照組皮下注射TP 1.0μg;氯化錳低、中、高劑量組在皮下注射1.0μg TP后,分別腹腔注射氯化錳7.5、15.0和30.0 mg/kg;陽性對照組在皮下注射1.0μg TP后,腹腔注射氟他胺100.0mg/kg,1次/d,連續(xù)7 d。于末次給藥后24 h,稱取質(zhì)量,用戊巴比妥鈉麻醉后股動脈采血,分離血清,采用放射免疫法分別測定 T和PSA含量;采血后處死動物,迅速剝離雄激素依賴組織腹側(cè)前列腺、精囊腺、尿道球腺、肛提肌和球海綿體肌(LABC肌)等,剔除周圍結(jié)締組織和脂肪,吸干表面血漬,于萬分之一天平上稱量以上剝離組織的濕質(zhì)量,計算臟器系數(shù),臟器系數(shù) =臟器濕質(zhì)量/大鼠體質(zhì)量。

1.6 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS 13.0對各組leydig細胞存活率、基礎(chǔ)狀態(tài)及HCG刺激下 T分泌水平、各組大鼠血清T和PSA水平及雄激素依賴組織的臟器系數(shù)行單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗,檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組leydig細胞存活率及T分泌水平比較見表1。

表1 各組leydig細胞存活率及T分泌水平比較(n=3)

2.2 各組去勢大鼠血清T與PSA水平及雄激素依賴組織臟器系數(shù)比較 見表2。

表2 各組去勢大鼠血清T與PSA水平及雄激素依賴組織臟器系數(shù)比較(n=10)

3 討論

睪丸leydig細胞的主要功能是合成和分泌T,并受黃體生成素(LH)調(diào)控。體外培養(yǎng)的leydig細胞不存在體內(nèi)相互作用的環(huán)境,失去了促性腺激素的節(jié)律性刺激作用,分泌雄激素的量大大減少。HCG與LH有相同的受體結(jié)構(gòu),可替代體內(nèi)LH的作用刺激 leydig細胞合成 T[5]。因此,作者采用HCG刺激leydig細胞分泌T。研究結(jié)果顯示,無論是在基礎(chǔ)狀態(tài)還是HCG刺激狀態(tài)下,隨氯化錳染毒劑量的升高,leydig細胞分泌T呈下降趨勢,說明氯化錳可抑制體外培養(yǎng)的leydig細胞合成T,原因可能是錳影響了 T合成過程中各種酶的功能[6],從而導(dǎo)致leydig細胞分泌T能力的下降。另一方面,隨著氯化錳劑量的升高,leydig細胞存活率下降,故不排除氯化錳對leydig細胞的直接影響導(dǎo)致T分泌能力的下降。

Hershberger實驗是最常用的篩檢環(huán)境抗雄激素物質(zhì)的體內(nèi)短期實驗方法,敏感而迅速[7]。該研究Hershberger實驗結(jié)果顯示,染毒組去勢大鼠血清T與PSA水平均高于陽性對照組,但與陰性對照組比較,差異無統(tǒng)計學意義,可能是氯化錳對外源性激素水平的影響不敏感。此外,高劑量氯化錳可使去勢大鼠的雄激素依賴組織腹側(cè)前列腺及精囊腺的臟器系數(shù)減小,提示腹側(cè)前列腺及精囊腺對氯化錳的雄激素抑制作用較敏感,在血清激素水平變化微弱的情況下,雄激素依賴組織依然對氯化錳的抑制作用表現(xiàn)明顯,說明錳可能有拮抗雄激素的作用。

[1]KogevinasM,SalaM,Boffetta P,etal.Cancer risk in the rubber industry:a review of the recent epidemiological evidence[J].Occup Environ Med,1998,55(1):1

[2]International Agency for Research on Cancer.The rubber industry,monographs on the evaluation of carcinogenic risk chem icals to human[M].Lyon:IARC,1982.

[3]竇京濤,李明,邵迎紅,等.用Percoll分離的大鼠睪丸間質(zhì)細胞對絨毛膜促性腺激素刺激的反應(yīng)[J].軍醫(yī)進修學院學報,1999,20(3):217

[4]孫祥宙,鄧春華,郭海彬,等.成人睪丸間質(zhì)細胞的培養(yǎng)和鑒定[J].中華男科學雜志,2005,11(5):356

[5]王鮮忠,潘紅梅,吳建云,等.FSH對體外培養(yǎng)間質(zhì)細胞睪酮生物合成的影響[J].中國農(nóng)學通報,2005,21(4): 13

[6]孫佳音,應(yīng)鋒,韓曉冬.睪丸間質(zhì)細胞中睪酮合成酶及蛋白表達的調(diào)控因子[J].生殖與避孕,2009,29(1):42

[7]Charles GD,Kan HL,Schisler MR,et al.A comparison of in vitro and in vivo EDSTAC test battery results for detecting antiandrogenic activity[J].Toxicol Appl Pharmacol, 2005,202(1):108