路 燕,滕軍放

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科鄭州 450052

#通訊作者,男,1960年11月生,本科,主任醫(yī)師,教授,研究方向:腦血管病防治及睡眠障礙治療,E-mail:tjf.6666@yahoo.com.cn

近年來缺血性腦血管病(ischemic cerebrovascular diseases,ICVD)的病因及發(fā)病機(jī)制研究已取得很大的進(jìn)展,高同型半胱氨酸血癥(HHcy)也被認(rèn)為是ICVD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一,而引起同型半胱氨酸(Hcy)升高的主要因素是其相關(guān)代謝酶的輔酶維生素缺乏。已發(fā)現(xiàn)亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR) C677T基因突變可引起血漿 Hcy水平升高,導(dǎo)致腦血管疾病的發(fā)生[1]。胱硫醚-β合成酶 (CBS) 844ins68基因多態(tài)性可造成CBS缺陷,引起重度HHcy及過早動脈粥樣硬化,從而導(dǎo)致血管內(nèi)多發(fā)血栓形成[2]。CBST833C基因突變與缺血性腦卒中存在關(guān)聯(lián),可能是缺血性腦卒中的遺傳危險(xiǎn)因素[3]。作者采用病例-對照研究探討 CBS T27796C基因位點(diǎn)多態(tài)性與ICVD的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 對象 92例ICVD患者(病例組)和52例對照(對照組)來自 2008年 12月至2009年 4月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院患者及門診體檢者,均為河南漢族人。病例組符合 1995年第 4屆全國腦血管病學(xué)術(shù)會議修訂的急性 ICVD的診斷標(biāo)準(zhǔn),并經(jīng)頭顱CT和(或)MRI檢查確診;對照組為無ICVD病史、無臨床血管事件發(fā)生的神經(jīng)內(nèi)科其他住院患者及健康體檢者。2組均排除腦出血、蛛網(wǎng)膜下腔出血等出血性腦血管疾病,均無帕金森病、癡呆、甲狀腺、肝臟及腎臟疾病及服用葉酸、維生素 B12及美多芭等藥物史。病例組 92例,男 68例,女 24例,年齡 39～86歲。對照組52例,男35例,女 17例,年齡 39～87歲。2組性別及年齡分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.712,P=0.399;t=1.548,P=0.124)。1.2 CBST 27796C基因多態(tài)性檢測 采用多聚酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法。取EDTA抗凝靜脈血2 m L,采用CBM公司基因提取試劑盒提取人全血基因組DNA。參照文獻(xiàn)[4]設(shè)計(jì)引物,上游引物5'-ACAATCAGCGGCATTTAGTA-3',下游引物5'-ACAGAGACACAAAGTCGATC-3',擴(kuò)增產(chǎn)物大小為176 bp。PCR反應(yīng)體系為30μL: PCRMagic Mix 2.0酶(CBM公司)15μL,上、下游

引物(10μmol/L)各2.0μL,模板DNA 2.0μL, ddH2O補(bǔ)至30μL。PCR擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性40 s,55℃復(fù)性40 s,72℃延伸90 s,循環(huán)34次;72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)25 g/L瓊脂糖凝膠電泳,EB染色檢驗(yàn)擴(kuò)增結(jié)果。酶切反應(yīng)體系為30μL:PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10μL,HpaⅡ2.0μL, 10×Buffer Tango 2.0μL,ddH2O 16μL。酶切產(chǎn)物在37℃水浴箱中溫浴3 h,經(jīng)30 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析,EB染色,紫外凝膠成像儀下觀察帶型并照相。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0處理。對2組基因型和等位基因頻率分布差異行 χ2檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn) 2組CBS T27796C基因型頻率的分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(病例組 χ2=2.938,對照組 χ2=2.848, P均 ＞0.05)。2組樣本有群體代表性。

2.2 2組CBS T27796C基因型及等位基因頻率分布 見表1。T/T野生型與C/C純合子基因頻率及C等位基因分布頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,T/T野生型與C/T純合子基因型頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 2組CBS T27796C基因型及等位基因頻率分布 例(%)

2.3 PCR-RFLP檢測結(jié)果 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)HpaⅡ酶切后,共有3種基因型:野生型(T/T型)只有176 bp;雜合子突變型(C/T型)有176、100和76 bp 3個(gè)片段;純合子突變型(C/C型)有100和76 bp 2個(gè)片段。CBS基因T27796C酶切產(chǎn)物見圖1。

圖1 PCR-RFLP產(chǎn)物電泳圖M:DNA Marker;1,2,4,6,10:C/C型;3,5,8:T/T型;7,9:C/T型。

3 討論

人類CBS基因位于 21q22-3染色體上,全長28 046 bp,可編碼 551個(gè)氨基酸。Kraus等[5]通過基因組序列分析發(fā)現(xiàn)人類CBS基因含有23個(gè)外顯子,片段長度從42 bp到299 bp不等。目前已發(fā)現(xiàn)CBS基因上至少存在著 80個(gè)位點(diǎn)突變,多為單位點(diǎn)突變,且均為單一型,多分布于第 3和第 8外顯子上。CBS基因所編碼的蛋白CBS是人體內(nèi)Hcy代謝的關(guān)鍵酶,人體內(nèi)約一半Hcy通過CBS和胱硫醚裂解酶不可逆地生成半胱氨酸;另一半則通過再甲基化形成蛋氨酸。此外,Hcy與半胱氨酸形成二硫化合物,使Hcy釋放于細(xì)胞外亦主要受CBS的影響[6]。

該研究結(jié)果顯示,病例組和對照組 CBS T27796C C等位基因頻率與 C/C基因型頻率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示CBST27796C基因純合子突變型可能與河南漢族人ICVD的發(fā)生有關(guān),可能是ICVD的遺傳影響因素之一。這與國內(nèi)報(bào)道[6]結(jié)果不一致,分析原因可能如下:①入選病例的排除標(biāo)準(zhǔn)不同、各種缺血性腦卒中所占比例不同及所選樣本量不同均可能造成研究結(jié)果不一致。②即使是同一種族在不同地區(qū)的基因突變率也可能不同,造成其遺傳易感性不同。③該研究所涉及的樣本量仍然相對較少,病例-對照研究所產(chǎn)生的偏倚也可能對研究結(jié)果產(chǎn)生影響。

該研究結(jié)果對于進(jìn)一步了解ICVD的發(fā)病機(jī)制及遺傳影響因素有一定的參考意義,但因CBS基因上有數(shù)十個(gè)突變位點(diǎn),因此不能否認(rèn)CBS為ICVD的易感基因,有待于進(jìn)一步在不同地區(qū)進(jìn)行大樣本、多中心研究。

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[5]Kraus JP,Oliveriusova J,Sokolova J,et al.The human cystathionineβ-synthase(CBS)gene:complete sequence, alternative splicing,and polymorphisms[J].Genomics, 1998,52(3):312

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