晁煒靜,李康華,戴榮平,韓 欽,閆 曦,趙 潺,于偉泓,董方田,趙春華#

1)中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)院眼科北京 100730 2)武警河南總隊醫(yī)院眼科 鄭州 450052 3)中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)科大學基礎醫(yī)學研究所組織工程中心 100730

#通訊作者,男,1963年6月生,博士,教授,研究方向:干細胞生物學基礎與臨床應用,E-mail:chunhuaz@pub lic.tpt.tj.cn

間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell,MSC)是成體干細胞的一種,存在于多種組織中,在體外具有很強的克隆形成和擴增能力,并具有向 3種胚層細胞分化的潛能。研究[1-3]發(fā)現(xiàn),骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow-mesenchymal stem cell,BM-MSC)在體外經(jīng)誘導可以分化為視網(wǎng)膜細胞,但是獲取 BMMSC有一定的創(chuàng)傷,且獲取數(shù)量有限。成人脂肪間充質(zhì)干細胞(human adipose derived-mesenchymal stem cell,hAD-MSC)與BM-MSC在干細胞的產(chǎn)率、生長動力學、多譜系分化潛能、基因轉導效率和表型等方面都相似,而且脂肪組織較骨髓來源豐富,容易取材,組織損傷小,所以hAD-MSC在臨床上的應用越來越受到人們的重視[4-6]。臨床上,很多眼科疾病受損傷的靶細胞為脈絡膜毛細血管內(nèi)皮細胞、視網(wǎng)膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelium,RPE)和光感受器細胞,延緩這些細胞的損傷、恢復其功能或者重建視網(wǎng)膜結構成為目前研究的重點。在該實驗中,作者首先從成人脂肪組織中分離得到hAD-MSC,經(jīng)體外誘導后,證明其可以分化為血管內(nèi)皮細胞;然后進一步制作視網(wǎng)膜細胞誘導液,體外誘導hAD-MSC分化為RPE、光感受器細胞,為進一步hAD-MSC體內(nèi)移植治療眼科相關疾病的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 hAD-M SC的分離、培養(yǎng)和鑒定

1.1.1 hAD-MSC的分離、培養(yǎng) 取健康成人脂肪組織,用D-Hank's液反復沖洗,1.0 g/L的Ⅰ型膠原酶 37℃消化 1 h,過 100目篩網(wǎng),將濾出液常溫離心10min(1 200 r/min),棄去上清液,再用D-Hank's液重懸洗滌2遍(1 200 r/m in室溫離心10 min)以除去Ⅰ型膠原酶,最后離心,棄去上清液,收集細胞,用移液管吹打使之成為單細胞懸液,以2×106mL-1的密度接種于含體積分數(shù)分別為58%DMEM/F12、40%MCDB-201、2%胎牛血清(FCS)和10μg/L表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)及1×胰島素-轉鐵蛋白-亞硒酸(ITS)及1×亞油酸-牛血清白蛋白(LA-BSA)的培養(yǎng)液中,37℃、體積分數(shù)為5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),2 d后換液,棄去未貼壁的細胞。以后每3 d半量換液。當細胞密度達70%～80%時,用1.25 g/L胰蛋白酶常規(guī)消化,細胞按照1:3進行傳代,實驗中使用的為第 2代或第 3代細胞。

1.1.2 hAD-MSC的免疫表型分析 用1.25 g/L胰酶常規(guī)消化hAD-MSC細胞,按每管2×105個細胞,用40.0 g/L多聚甲醛4℃固定10 min后,用含有1.0 g/L疊氮鈉和體積分數(shù)為 0.5%牛血清白蛋白(BSA)的PBS洗2遍,1 000 r/min室溫離心6 min,加入FITC或PE標記的小鼠抗人直標一抗,4℃孵育45min,FITC或PE標記的同種異型IgG1作為陰性對照。之后用PBS洗2遍,1000 r/min室溫離心6min,用0.5mL不含BSA的PBS重懸細胞,流式細胞儀檢測CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD105、Flk-1和MHCⅡ類分子的表達。檢測Flk-1時,在加入一抗前,用40.0 g/L多聚甲醛4℃固定10min,體積分數(shù)為0.1%皂素破膜1 h,其余步驟同上。

1.1.3 hAD-MSC的細胞周期測定 將1×106個細胞用體積分數(shù)為 80%的冷乙醇 4℃固定 1 h。PBS洗2遍,0.5 mL PBS重懸細胞,加100 mg/L的RNaseA,于37℃孵育30m in。測定前10 min加5 mg/L的碘化丙啶(PI)染色,上流式細胞儀(BD FAC Scan),汞燈488 nm波長激發(fā)光激發(fā)。以ModiFit軟件分析細胞周期。

1.2 hAD-MSC成血管內(nèi)皮細胞誘導 用Matrigel包被24孔培養(yǎng)板,按 5×104個細胞/孔接種hADMSC。內(nèi)皮細胞誘導液為 M 199、體積分數(shù)為 2% FBS、50μg/L血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelialgrowth factor,VEGF)、10μg/L成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)和100mg/L青霉素及0.1U/L硫酸鏈霉素。誘導2～3 d。光學顯微鏡下記錄hAD-MSC的細胞形態(tài)變化過程,并以免疫熒光方法鑒定分化結果,抗體分別為兔抗人血管內(nèi)皮細胞Ⅷ因子(vWF)一抗(Santa Cruz公司,工作濃度為1:100),Tritc標記的山羊抗兔IgG抗體(Santa Cruz公司,工作濃度為1:100)。

1.3 hAD-MSC成視網(wǎng)膜細胞誘導

1.3.1 誘導液制備 選取成年Lewis大鼠,頸椎脫臼處死,消毒,超凈工作臺上取出大鼠眼球,去除前節(jié)和玻璃體,小心用虹膜恢復器分離出完整的視網(wǎng)膜,將視網(wǎng)膜組織移入離心管中,加入1.0 g/L胰蛋白酶溶液后放入孵育箱中消化30 min,用含體積分數(shù)為10%FCS的DMEM終止消化,過濾,離心,收集視網(wǎng)膜細胞。將大鼠眼球剩下的眼杯放射狀剪開,鋪平后加入2.5 g/L胰蛋白酶,放入孵育箱中消化45min,用巴斯德吸管吸取培養(yǎng)液,輕輕吹打眼杯內(nèi)壁,以使RPE脫落,收集細胞懸液,離心,棄上清液,收集細胞。將 2種細胞共同接種于培養(yǎng)瓶中放入孵育箱培養(yǎng)。每天在顯微鏡下觀察,細胞生長良好后按5×105mL-1重懸于細胞培養(yǎng)液中,然后對培養(yǎng)瓶中的細胞照射10min,照射劑量1.0Gy/min。照射后將細胞懸液靜置 12 h,離心收集上清液,再加入等體積的細胞培養(yǎng)液,以此作為hAD-MSC的誘導母液備用。

1.3.2 成RPE和光細胞感受器誘導 hAD-MSC接種于 6孔板,以擴增培養(yǎng)液培養(yǎng),細胞貼壁 12 h后,換為上述配置的誘導母液培養(yǎng),同時加入 EGF (0.1 mg/L)、?；撬?50μmol/L)和視黃酸(0.5 μmol/L),每3 d半量換液,誘導培養(yǎng)10 d,免疫熒光方法鑒定分化結果,抗體分別為小鼠抗人視紫紅質(zhì)(Rhodopsin)單克隆抗體(Neomarker公司,工作濃度為1:50)、小鼠抗人細胞角蛋白(Pan-CK)單克隆抗體(Sigma公司,工作濃度為1:100)一抗和FITC標記或TRITC標記的羊抗小鼠抗體(Santa Cruz公司)。

2 結果

2.1 體外培養(yǎng)hAD-MSC的生物學性狀 從成人脂肪組織中分離得到的hAD-MSC在原代培養(yǎng)中,有2類細胞生長,一種細胞呈梭形,分散生長;另一種細胞呈多角形,緊密生長。經(jīng)過傳代,多角形細胞逐漸減少,傳至第 3代時,基本消失,視野中均為梭形細胞。免疫表型分析結果顯示:hAD-MSC高表達CD29、CD44、CD105和Flk-1,低表達MHCⅡ類分子,不表達造血及內(nèi)皮細胞標志(CD31、CD34和CD45)。細胞周期分析發(fā)現(xiàn)多數(shù)hAD-MSC位于G0/G1期。

2.2 hAD-MSC成血管內(nèi)皮細胞誘導結果 誘導最初的12 h內(nèi),接種的hAD-MSC由圓形逐漸伸展成短梭形,由分散狀態(tài)逐漸變成一些聚集的細胞群;24 h后,細胞簇變大,簇與簇之間連接,初步形成網(wǎng)格狀;48 h后,網(wǎng)格之間連線變細,由節(jié)點互相連接,形成網(wǎng)格樣結構(圖1A)。免疫熒光染色顯示,多數(shù)細胞表達血管內(nèi)皮細胞表面標志vWF(圖1B)。

2.3 hAD-M SC成RPE和光感受器細胞誘導結果

hAD-MSC在誘導因子和誘導液的共同作用下,細胞形態(tài)由圓形變得不規(guī)則,呈多角形,突起增多,免疫熒光染色顯示多數(shù)細胞表達 RPE細胞的表面標志Pan-CK(圖1C);亦有多數(shù)細胞表達光感受器細胞的表面標志Rhodopsin(圖1D)。

圖1 hAD-M SC體外誘導分化結果(×200)A:hAD-MSC成內(nèi)皮細胞誘導48 h后的形態(tài);B:hAD-MSC成內(nèi)皮細胞誘導48 h vWF免疫熒光染色;C:hAD-MSC成RPE誘導后Pan-CK免疫熒光染色;D:hAD-MSC成光感受器細胞誘導后Rhodopsin免疫熒光染色。

3 討論

視網(wǎng)膜變性疾病包括視網(wǎng)膜色素變性、年齡相關性黃斑變性等,是眼科主要的致盲性疾病,目前尚缺乏有效的治療手段。隨著人們對干細胞的深入研究,干細胞移植為視網(wǎng)膜變性疾病的治療帶來新的希望,其中種子細胞的選擇是關鍵環(huán)節(jié)[2-3]。干細胞分為胚胎干細胞和成體干細胞兩大類。胚胎干細胞的分化潛能大,可以向內(nèi)、中和外 3個胚層的細胞和組織分化,但是倫理學問題限制了其廣泛應用。成體干細胞也具有多向分化潛能,而且取材容易,不存在倫理學問題,成為近年來研究的熱點。成體干細胞中,AD-MSC可以體外分化為脂肪細胞、心肌細胞、神經(jīng)細胞、骨細胞、軟骨細胞[7]、血管內(nèi)皮細胞[8]、平滑肌細胞[9]和骨骼肌細胞[10]等,但是還沒有關于AD-MSC向視網(wǎng)膜細胞方面分化的報道。

作者對hAD-MSC體外誘導為視網(wǎng)膜細胞進行了研究,借鑒了Kicic等[2]誘導BM-MSC分化為視網(wǎng)膜光感受器細胞的方法,選用了 EGF、視黃酸和牛黃酸,這些因子不管是在胚胎眼還是出生后眼光感受器細胞的發(fā)育過程中均起重要的促進作用。同時,為了更好的誘導hAD-MSC的分化,作者還對誘導方法加以改進,制備了體外誘導液。Xiao等[11]研究證實,當分離培養(yǎng)得到的視網(wǎng)膜細胞受到照射損傷時會應激產(chǎn)生一些生長因子,如:胰島素樣生長因子Ⅰ(insulin-like growth factorⅠ,IGF-Ⅰ)、bFGF、轉化生長因子(transforming growth factor,TGF)、血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor, PDGF)和VEGF等,這些生長因子在組織損傷愈合過程中起重要作用,可以促進受傷部位的細胞有絲分裂、合成細胞外基質(zhì)等。所以作者把培養(yǎng)的視網(wǎng)膜細胞進行照射,使細胞應激分泌生長因子到培養(yǎng)液里,收集這些培養(yǎng)液制備成hAD-MSC的誘導母液,誘導母液中的生長因子就會發(fā)揮作用,聯(lián)合誘導劑的應用,可以創(chuàng)造一個更好的細胞誘導微環(huán)境。

該實驗證實,hAD-MSC可以體外誘導分化為血管內(nèi)皮細胞,并且在誘導劑和誘導液的共同作用下, hAD-MSC還可以體外誘導分化為視網(wǎng)膜RPE和光感受器細胞,這為進一步的hAD-MSC體內(nèi)分化研究和對視網(wǎng)膜疾病的治療奠定了基礎。

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