陳廣理1,2)△,龔樹生3),陳 沛1),羅凌惠1)

1)華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院耳鼻咽喉科武漢 430022 2)洛陽東方醫(yī)院耳鼻咽喉科洛陽 471003 3)首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科北京 100730

△男,1971年4月生,博士,副主任醫(yī)師,研究方向:耳鼻咽喉疾病的基礎(chǔ)與臨床,E-mail:glchen71@yahoo.com.cn

堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)是內(nèi)皮細胞促進作用最強、特異性最高的因子之一[1],bFGF主要是通過其高親和力酪氨酸激酶受體(fibroblast growth factor receptor,FGFR)和細胞表面的硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycans,HSPG)組成的雙受體系統(tǒng)發(fā)揮生物活性[2],共同促進細胞的增殖、分化,誘導新生血管的形成[3-4],與肺癌、食管癌、肝癌及黑色素瘤等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[5-7]。串珠素(perlecan)是一種重要的HSPG,bFGF與perlecan的結(jié)合是bFGF與其高親和力受體相結(jié)合的必要條件[8]。喉癌是具有一定浸潤和轉(zhuǎn)移能力的腫瘤。作者分析了bFGF、FGFR1～4及perlecan mRNA在喉癌細胞Hep-2中的表達,探討其與喉癌細胞生長、浸潤及轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和設(shè)備 RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Hyclon公司),胎牛血清(美國Sigma公司),Trizol試劑(美國Gibco公司),逆轉(zhuǎn)錄酶MLV、Taq DNA聚合酶及dNTP(美國MBI公司),PTC200 PCR儀(美國MJA公司),DU650型紫外分光光度儀(美國Beckman公司),GDS8000型凝膠成像系統(tǒng)(英國UVP公司)。

1.2 細胞培養(yǎng) 人喉癌細胞系Hep-2和正常永生化表皮細胞系HaCaT購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心。Hep-2和HaCaT細胞用含體積分數(shù)10%的胎牛血清和300 mg/L谷氨酰胺的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)條件為37℃、體積分數(shù)5%CO2。每2～3 d用2.5 g/L胰蛋白酶消化并傳代一次。

1.3 2種細胞內(nèi)bFGF、FGFR及perlecan m RNA的檢測 將90%底壁長滿細胞(約6×106個細胞)的100mL培養(yǎng)瓶置于冰上,吸去培養(yǎng)液,直接加入1m L Trizol試劑,反復吹打,然后按說明用氯仿和異丙醇逐步提取RNA。以RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板,以β-actin為內(nèi)參照物,進行PCR,引物設(shè)計見表1[9],引物由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成。反應體系(25μL)中含cDNA 2.0μL,10×PCR緩沖液2.5μL,Mg2+終濃度為2.0mmol/L,dNTP終濃度為0.2 mmol/L,上、下游引物終濃度為0.2μmol/L,Taq DNA聚合酶1 U。反應條件:95℃預變性5min;95℃1 min,55℃1 min,72℃1 min,共34個循環(huán);然后72℃延伸5 min。應用降落PCR方法進行FGFR3與β-actin的PCR。反應結(jié)束后取5μL產(chǎn)物用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳,紫外燈下觀察并用Grab-It成像系統(tǒng)照相,然后用Gelworks 1D Interdiate軟件分析各條帶的吸光度值,以目的基因與β-actin條帶吸光度值的比值表示目的基因的相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學處理 用SPSS 12.0進行分析,2種細胞中bFGF、FGFR1～4及perlecan mRNA相對表達量的比較用兩獨立樣本的t檢驗,檢驗水準α=0.05。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2種細胞中均未檢測到FGFR3 mRNA。Hep-2及HaCaT細胞中bFGF、perlecan、FGFR1、FGFR2及FGFR 4 mRNA的檢測結(jié)果見圖1～4及表2。

表2 Hep-2及HaCaT細胞中bFGF、FGFR及perlecan mRNA的相對表達量

3 討論

bFGF主要是通過高親和力受體FGFR和輔助受體perlecan系統(tǒng)發(fā)揮重要生物活性,在大多數(shù)腫瘤組織中高表達,且 3者同時高表達預示腫瘤分化程度更低,更容易浸潤和轉(zhuǎn)移[9]。bFGF和perlecan結(jié)合可抵抗蛋白酶的降解,延長bFGF的作用時間,并增強其穩(wěn)定性。bFGF與perlecan的結(jié)合也是bFGF與FGFR相結(jié)合的必要條件[8],游離的bFGF不能直接與FGFR作用。bFGF和perlecan結(jié)合是調(diào)節(jié)bFGF活性的一種手段。因此,bFGF及其雙受體系統(tǒng)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切,成為判斷腫瘤惡性程度、預測轉(zhuǎn)移和預后的指標。

作者的研究結(jié)果表明,bFGF、FGFR1、FGFD2、FGFD4及perlecan mRNA在喉癌細胞Hep-2中高表達,在正常HaCaT細胞中低表達,并且表達較恒定, 2種細胞中均未檢測到FGFR3mRNA。說明Hep-2細胞不但分泌bFGF,而且可分泌bFGF的雙受體, Hep-2細胞中bFGF與perlecan及FGFR雙受體緊密結(jié)合,通過信號轉(zhuǎn)導,促進Hep-2細胞快速生長和失控增殖。喉癌細胞Hep-2的發(fā)生發(fā)展與bFGF、perlecan和FGFR的關(guān)系密切,喉癌細胞具有失控增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移特征。因此,bFGF及其雙受體在喉癌細胞中的表達可為診斷提供依據(jù)。同時它們也是治療的重要靶分子,抑制或阻斷bFGF及雙受體系統(tǒng)在喉癌細胞中的表達可能對抑制腫瘤生長、浸潤及轉(zhuǎn)移有重要價值。

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