董偉

(紅塔煙草(集團)有限責任公司技術中心,云南玉溪653100)

煙草底料產(chǎn)品中的低聚糖主要由水蘇糖、棉籽糖和蔗糖3種低分子糖組成,棉子糖又稱蜜三糖,是由半乳糖以α-1,6糖苷鍵與蔗糖的葡萄糖基連接所形成;水蘇糖為四糖,是由棉子糖的半乳糖以α-1,6糖苷鍵與半乳糖連接而成。

目前,低聚糖的測定方法,以紙層析法、薄層層析法、氣相色譜法、液相色譜法為主,除液相色譜外,以上方法普遍存在樣品前處理復雜、靈敏度低、雜質(zhì)干擾大等缺陷。近些年來,高效液相色譜法并配以氨基色譜柱已較為普遍,該法樣品前處理簡單并能直接測定,還可減少糖的損失或偶然誤差。但是,樣品中還原糖易與氨基色譜柱中固定相成分發(fā)生化學反應,從而導致色譜柱使用壽命大大縮短,另外,該法使用乙腈配制流動相,大大增加了分析測試成本。作者選用Waters Sugar Pak1鈣型陽離子交換色譜柱,以純水作為流動相,研究建立了低聚糖的測定方法,并將其應用于煙草底料中蔗糖、棉籽糖和水蘇糖的分析測定。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

Waters 600高效液相色譜儀,配有Waters600四元輸液泵,2410示差折光檢測器,7725i進樣閥,Empower2色譜工作站;Waters Sugar Pak1鈣型陽離子交換色譜柱(6.5 mm×300 mm),Sep-Pak Alumin Cartridges保護柱;Milli2Q50超純水儀處理后的純水;EDTA鈣鈉:色譜級;蔗糖、棉籽糖、水蘇糖標準樣品,Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 標準溶液的配制

分別準確稱取250 mg水蘇糖、棉籽糖和蔗糖,以純水溶解并定容至10 mL,得到濃度為25 mg/mL的儲備液;然后分別配制成3種組分濃度均為1.0、2.5、5.0、7.5、10.0 mg/mL 的標準混合溶液 ,4℃冰箱中保存。

1.3 樣品的制備與測定

準確稱取煙草底料產(chǎn)品1 g左右至10 mL容量瓶中,加入5 mL體積分數(shù)70%乙醇,超聲波輔助浸提10 min,以無水乙醇定容至刻度,振搖,取上清液用0.45μm有機相微孔膜過濾,濾液供 HPLC分析。

2 結果與討論

作者選用 Waters Sugar Pak1色譜柱,該色譜柱采用Ca2+型陽離子交換樹脂作為填料,該填料使用聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物做骨架,由于高聚物的多孔特性,具有體積排阻的分離機理,使得樣品中的Ca2+物質(zhì)先被洗脫出來,物質(zhì)后被洗脫出來。此外,Sugar Pak1色譜柱還具有配位交換作用,糖分子端基異構碳上所帶羥基可被去質(zhì)子化后帶上強的負電荷,這些負電荷與色譜柱的樹脂表面金屬離子Ca2+離子所帶的正電荷之間的相互作用可使糖分子在色譜柱上保留,并在洗脫時根據(jù)保留性質(zhì)的強弱達到分離。通過Sugar Pak1色譜柱的雙重分離機理,可使煙草制品低聚糖樣品的糖組分得到分離,所以該實驗選用Sugar Pak1色譜柱。

2.1 檢測器的選擇

與紫外可見吸收檢測器(UVD)相比,示差折光檢測區(qū)(RID)的靈敏度較低,待測組分在紫外光區(qū)無特征吸收峰,且待組分在樣品中的含量較高,可選用示差折光檢測器檢測。

2.2 流動相的選擇

Waters Sugar Pak1鈣型陽離子交換柱一般以水作流動相,水中加入少量EDTA鈣鈉可減少柱材料上的鈣離子流失,延長柱的壽命[1];作者考察了流動相中加入體積分數(shù)5%甲醇、乙腈及四氫呋喃等親水性有機溶劑作調(diào)節(jié)劑對分離的影響。結果顯示,加有機溶劑對分離并無明顯改善作用,故實驗選用0.05 g/L EDTA鈣鈉水溶液作為流動相。

2.3 柱溫的選擇

在室溫(18～25℃)下,低聚糖組分分離度較低,峰型較差,且色譜柱壓力較大,容易損傷色譜柱。實驗表明,柱溫保持在70～90℃之間均可使幾種組分得到較好的分離且色譜柱的壓力較小,本實驗柱溫控制為85℃。

2.4 色譜條件的最終確定

根據(jù)以上實驗最終確定色譜條件。在此色譜條件下將水蘇糖、棉籽糖和蔗糖混合標準溶液進樣,得到標準混合溶液色譜圖1。

圖1 棉籽糖、水蘇糖和蔗糖色譜圖Fig.1 Chromatograms of oligosaccharides standard solution

2.5 線性關系、檢測限、回收率的考察

以濃度分別為 1.0、2.5、5.0、7.5、10.0 mg/mL低聚糖標準品工作液進行檢測,每個濃度重復3次,計算平均值。將3種低聚糖峰面積對其相應濃度進行線性回歸計算,得出相關系數(shù)r,結果見表1。圖1為低聚糖混合標樣的色譜圖,從中可以看出,3種低聚糖能夠在15min以前全部洗脫出來,并且分離度良好。由表1可見,3種低聚糖的峰面積與其濃度呈現(xiàn)線性關系(r>0.99),其中3種糖的相關系數(shù)都在0.9993～0.9997之間,說明在設定的濃度范圍內(nèi)線性關系良好;通過分析稀釋后的標準品儲備液,以3倍信噪比(S/N)計算檢測限;樣品平行測定5次,考察方法精密度。結果見表1。

樣品通過添加不同質(zhì)量濃度(1.0、3.0、5.0 mg/mL)3種低聚糖混標進行回收試驗,基質(zhì)及各加標水平樣品平行測定3份,以外標法進行定量,并計算3個加標水平下的平均回收率,結果如圖2及表2所示。3種低聚糖的平均回收率為96.9%～103.5%。

2.6 樣品的測定

采用本實驗建立的提取、分析方法,分別就煙草底料產(chǎn)品中低聚糖含量進行了測定,并計算出低聚糖的含量,結果如表3所示。

表1 HPLC法檢測3種低聚糖的回歸方程、相關系數(shù)及檢出限Tab.1 Regress equation,r and detection limits of oligosaccharides detected by HPLC

表2 3種低聚糖的回收率測定Tab.2 Recovery tests for three kinds of oligosaccharides

圖2 煙葉底料樣品的色譜圖Fig.2 Chromatograms of tobacco casing materials

表3 低聚糖 HPLC測定結果Tab.3 Results of oligosaccharides detected by HPLC

3 結 語

高效液相色譜法采用Waters Sugar Pak1鈣型陽離子交換色譜柱測定煙草底料產(chǎn)品中低聚糖含量,能使3種低聚糖在15 min內(nèi)良好分離。該法重現(xiàn)性好,靈敏度高,能夠快速測定煙草底料產(chǎn)品中低聚糖的含量,可推薦用于卷煙加料工序或香精香料品質(zhì)控制工序過程中的常規(guī)分析測定。

[1]Kolwkar T G,Keskav V S.Determination of Sugars in Sugar Beet with High Performance Liquid Chromatography[J].International Sugar Journal,1998,192(1):164.