路青, 華兆哲, 李秀芬, 葛富青, 堵國成, 陳堅

(1.江南大學(xué)環(huán)境與土木工程學(xué)院,江蘇無錫 214122;2.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無錫 214122)

MBR中厭氧氨氧化運(yùn)行特性及微生態(tài)結(jié)構(gòu)

路青1, 華兆哲＊2, 李秀芬1, 葛富青1, 堵國成2, 陳堅2

(1.江南大學(xué)環(huán)境與土木工程學(xué)院,江蘇無錫 214122;2.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無錫 214122)

研究了膜生物反應(yīng)器(MBR)中厭氧氨氧化(Anammox)的運(yùn)行特性與微生態(tài)結(jié)構(gòu)變化。采用含氮模擬廢水進(jìn)行試驗(yàn),最終獲得粒徑集中在0.2～1 mm的紅褐色厭氧氨氧化顆粒污泥。運(yùn)行結(jié)果顯示,厭氧氨氧化菌能夠承受的容積負(fù)荷達(dá)0.245 kgTN/(m3·d);總氮、NH4+-N和NO-2-N去除率分別達(dá)到80%、81%、91%。水力負(fù)荷沖擊試驗(yàn)表明,當(dāng)HRT從14 h下降到7.9 h時,NH4+-N、NO-2-N去除率相對穩(wěn)定,分別保持在75%和85%左右,厭氧氨氧化仍然能夠穩(wěn)定進(jìn)行。通過末端限制性酶切片斷長度多態(tài)性(T-RFLP)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),反應(yīng)器運(yùn)行完成后微生物呈多態(tài)性分布,優(yōu)勢菌突出,其中起Anammox作用的菌屬主要為planctomyce、pirellula、gemmata、pseudomonas,這為厭氧氨氧化運(yùn)行過程中微生物群落結(jié)構(gòu)變化提供理論依據(jù)。

膜生物反應(yīng)器;厭氧氨氧化;顆粒污泥;微生物種群分布

厭氧氨氧化(Anaerobic ammonia oxidation, Anammox)是在厭氧或缺氧條件下,厭氧氨氧化微生物以N H4+-N為電子供體,NO2--N為電子受體,生成氮?dú)獾纳镞^程[1]。據(jù)報道,實(shí)驗(yàn)室規(guī)模處理模擬廢水基質(zhì)氮去除速率最高達(dá)26.0 kg/(m3·d)[2],生產(chǎn)性Anammox反應(yīng)器處理污泥壓濾液,基質(zhì)氮去除速率最高達(dá)9.5 kg/(m3·d)[3]。

然而Anammox在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的反應(yīng)器中啟動往往要幾個月甚至一年[4-10],在實(shí)際應(yīng)用啟動階段則需要3年多[3]。主要是由于Anammox菌的生長速率低、細(xì)胞產(chǎn)率低、Anammox微生物由于大量氣泡的產(chǎn)生易被出水洗出[4]。因此,必須尋求更為有效的反應(yīng)系統(tǒng)或操作方式來避免生物量的流失[5-10]。

啟動階段獲得高的生物保留量十分重要,因?yàn)榧词故巧锪课⑿〉牧魇б矔斐蓡訒r間的延遲[11-13]。膜生物反應(yīng)器(Membrane Bioreactor, MBR)是膜組件與生物反應(yīng)器的有機(jī)結(jié)合,可將幾乎全部的微生物保留在反應(yīng)器中,較高的污泥濃度可使污染物去除率提高[14-15]。Wyffels[16]第一次成功把MBR運(yùn)用到Canon(completely autotrophic nitrogen removal over nitrite)工藝中,接著Trigo C[17]接種馴化好的Anammox顆粒污泥,研究MBR的啟動過程中發(fā)現(xiàn),在MBR中沒有出現(xiàn)NO2--N的積累、微生物以顆粒形式聚集生長。因此,MBR有利于增殖緩慢的微生物,如Anammox菌的截留生長。作者在MBR中接種普通厭氧顆粒污泥,研究反應(yīng)器中Anammox的運(yùn)行特性和微生物結(jié)構(gòu)變化,旨在為建立Anammox快速啟動的適宜條件提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 MBR反應(yīng)器及運(yùn)行條件

MBR反應(yīng)器見圖1。該裝置由機(jī)玻璃制成,有效容積1 L,內(nèi)徑80 mm,高220 mm。U型中空纖維膜組件由杭州浙大凱華公司生產(chǎn),孔徑為0.1～0.2μm,材質(zhì)為聚丙烯。

運(yùn)行條件:p H為7.6±0.15,溫度為(32±1)℃,水力停留時間為1 d。半連續(xù)運(yùn)行,具體為進(jìn)水1 h,循環(huán)22.5 h,靜止0.2 h,出水0.3 h。

圖1 MBR反應(yīng)器裝置圖Fig.1 Sketch of membrane reactor for anammox enrichment

1.2 接種污泥及試驗(yàn)用水

反應(yīng)器接種污泥來自無錫檸檬酸廠污水處理反應(yīng)器的厭氧顆粒污泥,總固體質(zhì)量濃度(TS)14.8 g/L,揮發(fā)性固體質(zhì)量濃度(VS)9.6 g/L,VS/TS為0.65。試驗(yàn)用水為人工模擬廢水,具體成分見表1。

表1 模擬廢水組成[17]Tab.1 Composition of the synthetic media

1.3 分析測試方法

1.3.1 物理性質(zhì)測定

1)污泥粒徑:從反應(yīng)器內(nèi)取一定量污泥,用水沖洗后使之依次通過1.5、1、0.8、0.5、0.2 mm的分樣,然后將各個分樣篩截留的污泥收集,在105℃下烘干、稱重,計算不同粒徑范圍的污泥所占比例(質(zhì)量比)。

2)污泥體積指數(shù)(SVI)、TS、VS:質(zhì)量法。

1.3.2 化學(xué)分析

1)Anammox污泥活性測定[18]:在250 mL搖瓶中加入一定量待測污泥樣品,NH4+-N和NO-2-N質(zhì)量濃度均為70 mg/L的模擬廢水混合,用丁基橡膠塞密封,并用氮?dú)庵脫Q搖瓶頂端空氣2～3 min,避光置于30℃恒溫水浴中。根據(jù)反應(yīng)進(jìn)行的程度,定時測定NH4+-N、NO3--N和NO-2-N的質(zhì)量濃度?？偟?TN)=N H4+-N+NO-2-N-NO3--N。

2)氨氮:水楊酸-次氯酸鹽光度法。

3)亞硝基氮:N-(1-萘基)-乙二胺光度法。

4)總氮:紫外分光光度法。

5)p H:DEL TA 320 p H計。

1.3.3 微生態(tài)結(jié)構(gòu)分析

1)DNA提取、純化:采用3S柱離心式環(huán)境樣品DNA回收試劑盒法,TaKaRa純化試劑盒法對DNA純化。

2)PCR擴(kuò)增和純化:采用總細(xì)菌引物27F/ 1492R擴(kuò)增體系(總體積50μL):10×PCR buffer 5μL,MgCl22 mmol/L,dNTPs 120μmol/L,正反引物各20μmol/L,模板1μL,Taq酶2.5μL,加超純水至終體積為50μL。擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性5 min,94℃變性1 min,72℃退火1 min,30個循環(huán), 72℃延伸7min,最后4℃保存。TaKaRa純化試劑盒法對擴(kuò)增產(chǎn)物純化。

3)酶切:PCR純化產(chǎn)物用MspI/HhaI2種酶分別進(jìn)行消化,MspI酶切體系為(總體積為20 μL):10×Taq buffer 2.0μL,50～100 ng PCR產(chǎn)物,0.1%BSA 2μL,2.5μL酶,加超純水至終體積20μL?；旌弦涸?7℃停留過夜,然后在65℃停留10 min,滅活,12℃保留,終止反應(yīng)。

消化產(chǎn)物由上海基康生物公司進(jìn)行檢測,檢測數(shù)據(jù)包含末端片斷長度和峰面積,用威斯康星—麥迪遜大學(xué)建立的基于Web(http://trflp.limnology.wisc.edu/assignment.jsp)的T-RFLP數(shù)據(jù)分析方法進(jìn)行分析處理[19]。

2 結(jié)果與討論

2.1 MBR中厭氧氨氧化過程的物理特征

2.1.1 污泥質(zhì)量濃度 圖2顯示的是MBR中污泥總固體質(zhì)量濃度(TS)、揮發(fā)性固體質(zhì)量濃度(VS)和VS/TS比值隨時間的變化。在反應(yīng)器運(yùn)行過程的前期,污泥質(zhì)量濃度會有所下降,后期則逐步上升;而VS/TS比值則隨時間的增加而增加,由初始的0.66提高到0.77,表明體系中的生物量經(jīng)歷了一個減少到增加的過程。

圖2 MBR中污泥質(zhì)量濃度隨時間的變化Fig.2 Time-courses of sludge concentration in the MBR

2.1.2 污泥顏色 接種的厭氧顆粒污泥為黑色,經(jīng)過長時間馴化后變成紅褐色,且隨運(yùn)行時間的延長紅色逐漸加深。根據(jù)相關(guān)報道,Anammox菌含有豐富的細(xì)胞色素c[20],成熟的厭氧氨氧化污泥呈淺紅色,污泥顏色越紅,Anammox活性越高[18,21]。因此,從污泥顏色變化看,本實(shí)驗(yàn)中馴化后的微生物已具備了厭氧氨氧化菌的外觀特征。

2.1.3 污泥粒徑 反應(yīng)器運(yùn)行前后的污泥粒徑分布分別見圖3,4。可以發(fā)現(xiàn),厭氧氨氧化運(yùn)行完成后,MBR內(nèi)顆粒污泥粒徑主要集中在0.2～1.0 mm之間。為了確定顆粒污泥對反應(yīng)器脫氮的貢獻(xiàn),測定了反應(yīng)器中顆粒污泥的Anammox活性。經(jīng)計算顆粒污泥的Anammox活性約為106 mg/ kgTN/(m3·d),據(jù)此推斷顆粒污泥是MBR中Anammox功能的重要承載者。

圖3 馴化前污泥粒徑分布Fig.3 Diameter distribution of the inoculated sludge

圖4 馴化后污泥粒徑分布Fig.4 Diameter Distribution of the incubated sludge

2.2 MBR中厭氧氨氧化過程的化學(xué)特征

2.2.1 氮素的變化 Anammox反應(yīng)器運(yùn)行是Anammox菌的活化富集過程。由圖5～7可以看出,Anammox反應(yīng)器運(yùn)行的0～10 d中,由于接種顆粒污泥中存在許多異養(yǎng)菌,而進(jìn)水不含有機(jī)物,污泥中異養(yǎng)反硝化菌首先利用污泥中的有機(jī)物和NO-2-N進(jìn)行反硝化,隨后微生物由于自身消耗釋放出NH4+-N,導(dǎo)致出水NH4+-N質(zhì)量濃度高于進(jìn)水,NO-2-N和NO3--N質(zhì)量濃度基本為0。由于啟動初期反應(yīng)器內(nèi)出現(xiàn)強(qiáng)烈的反硝化,出水NO2-N幾乎為0。為了給Anammox微生物提供足夠的電子受體,第12天,將進(jìn)水NO-2-N質(zhì)量濃度提高至98 mg/L。

圖5 MBR中氨氮變化曲線Fig.5 Profiles of NH4+-Nremoval in the MBR

第28天,出水NO-2-N上升為21 mg/L,為了防止基質(zhì)抑制作用,降低進(jìn)水NO-2-N質(zhì)量濃度。之后出水NO-2-N穩(wěn)定。NH4+-N去除率有所升高,但是提高幅度不大且不穩(wěn)定,在10%～30%間波動。隨著Anammox菌的富集,NH4+-N和NO-2-N去除率進(jìn)一步升高,出水NO3--N濃度逐步升高。Anammox菌從NO-2-N轉(zhuǎn)化為NO3--N過程中獲得還原力用于同化CO2,NO3--N的增長代表了微生物的增長。一般以N H4+-N和NO-2-N按一定比值(NH4+/NO-2-N:0.25～2)去除,標(biāo)志Anammox反應(yīng)的達(dá)成[22]。86 d時,去除的NH4+-N、NO-2-N和生成的NO3--N的比值為1∶1.14∶0.13,表明Anammox反應(yīng)已經(jīng)成為主導(dǎo)反應(yīng)。

圖6 MBR中亞硝基氮變化曲線Fig.6 Profiles of NO-2-Nremoval in the MBR

圖7 MBR中總氮變化曲線Fig.7 Profiles of nitrogen removal in the MBR

第87天,逐步縮短HRT至14 h,經(jīng)過23 d的運(yùn)行,最終Anammox反應(yīng)器的容積總氮負(fù)荷達(dá)0.245 kg/(m3·d),去除率為80%,出水NH4+-N和NO-2-N去除率分別為81%、91%。2.2.2 抗負(fù)荷沖擊能力 保持進(jìn)水N H4+-N、NO-2-N質(zhì)量濃度分別為70 mg/L,以每兩天增加10%進(jìn)水量的方式,研究反應(yīng)器的抗水力負(fù)荷能力,以進(jìn)水量提升前后的基質(zhì)去除速率的變化情況作為效能指標(biāo)評價反應(yīng)器運(yùn)行的穩(wěn)定性。由圖8可知,當(dāng)水力停留時間(HRT)由14 h縮短至7.9 h時,反應(yīng)器表現(xiàn)出較好的抗沖擊能力,MBR中NH4+-N、NO-2-N去除率分別是75%、85%,而繼續(xù)縮短至5.4 h時,NH4+-N、NO-2-N去除率分別是50%、61%。說明當(dāng)HRT縮短到一定程度時,進(jìn)水中的N H4+-N、NO-2-N與Anammox菌接觸時間過短,反應(yīng)不能達(dá)到充分。試驗(yàn)期間NO-2-N和NH4+-N的去除量比值在1.1～1.3之間,表明在Anammox反應(yīng)依然是主導(dǎo)反應(yīng),當(dāng)HRT在7.9 h以上時,MBR具有良好的耐沖擊能力。

2.2.3 p H值的變化 反應(yīng)器運(yùn)行過程中的p H值變化見圖9。在運(yùn)行初期,出水p H值遠(yuǎn)高于進(jìn)水,最高達(dá)到了8.81,這是由于啟動初期,微生物反硝化產(chǎn)堿所致。隨著NO-2-N去除率的下降,反應(yīng)器內(nèi)微生物產(chǎn)堿作用減弱,p H值開始逐漸下降。由于Anammox過程是一個耗酸的過程[1],隨著Anammox菌的富集,55 d后出水p H值開始升高,最終穩(wěn)定在8.4左右。

圖8 HRT對MBR中NH4+-N和NO-2-N去除率的影響Fig.8 Effects of HRT on ammonium and nitrite removals in the MBR

2.3 MBR中厭氧氨氧化過程的微生物種群特征

圖10是用遺傳分析儀AB13700掃描微生物16S rDNA PCP擴(kuò)增產(chǎn)物的HhaⅠ和MspⅠ雙酶切片段的圖譜。酶切圖譜上每一個末端限制性酶切片段(TRFs)至少代表一種類型的微生物,峰的面積反映出該種類的相對數(shù)量。從圖中可以直接地反映出MBR啟動前后污泥中微生物種類和相對數(shù)量的變化

作者對MBR系統(tǒng)中微生物的研究過程共100多天。在長時間的富集培養(yǎng)過程中,微生物種群變化十分明顯。利用Sorenson′s法計算多樣性指數(shù)(H′)。計算公式:H′=-∑(n/N)ln(n/N),式中n為每個波峰的面積,N為所有波峰的面積,算出富集前后微生物多樣性指數(shù)分別2.0、2.5,說明污泥種群數(shù)量出現(xiàn)小幅度增加,污泥中細(xì)菌種群數(shù)量變化趨勢與VS/TS變化及氮素去除情況相吻合。由圖10可以看出,MBR啟動后,污泥中優(yōu)勢菌群突出。反應(yīng)器中優(yōu)勢菌群的種類、數(shù)量可能直接關(guān)系到反應(yīng)器功能的強(qiáng)弱,因?yàn)榧词乖谒_擊(HRT由14 h縮短至7.9 h)的情況下,也有助于系統(tǒng)的穩(wěn)定運(yùn)行。根據(jù)生態(tài)學(xué)中的“多樣性導(dǎo)致穩(wěn)定性原理”,物種多樣化具有穩(wěn)定生態(tài)系統(tǒng)的功能特征[23]。因此,MBR中微生物菌群呈現(xiàn)多樣性分布有利于穩(wěn)定的厭氧氨氧化。MBR反應(yīng)器運(yùn)行前后微生物種群結(jié)構(gòu)對比見圖11。

圖9 MBR中pH值變化曲線Fig.9 The changes of pH in the MBR

圖10 16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物兩種酶切片段圖譜Fig.10 The 16S rDNA PCRamplified production after enzyme digestion

圖11 MBR反應(yīng)器運(yùn)行前后微生物種群結(jié)構(gòu)對比Fig.11 Comprison of microbial communities between before and after Anammox process in the MBR

由圖11可以看出,運(yùn)行前后微生物類群發(fā)生了顯著的變化。運(yùn)行后系統(tǒng)中部分菌屬如Clostridia,Flavobacteria等基本消失,出現(xiàn)planctomyce、pirellula、gemmata、pseudomonas等新的種屬。每種類群的豐富度是其相對面積與總物種群落面積的比值。啟動成功后污泥中Betaproteobacteria(從37%到44.5%)、Gammaproteobacteria(從6%到17.1%)出現(xiàn)了不同程度的增加,Chlorof lexi(10.7%到4.8%)、Actinobacteria(17.8%到4%)、Planctomycetacia(從0%到9.5%)得到富集,浮霉?fàn)罹牡蜕L率使其只有少量富集。迄今為止已確認(rèn)的Anammox菌屬都?xì)w于浮霉菌門。對于啟動后出現(xiàn)的planctomyce、pirellula、gemmata、pseudomonas等菌屬,相關(guān)文獻(xiàn)已證明[24-25]其Anammox活性。而對于啟動后出現(xiàn)的其他優(yōu)勢菌屬是否具有Anammox活性,還需進(jìn)一步研究。

3 結(jié) 語

1)經(jīng)運(yùn)行,在MBR中成功富集得到Anammox菌,容積總氮負(fù)荷達(dá)0.14 kg/(m3·d)。通過縮短HRT加快Anammox菌生長,當(dāng)HRT縮短至14 h,容積總氮負(fù)荷達(dá)0.245 kg/(m3·d),總氮去除率約80%,出水NH4+-N和NO2--N去除率分別為81%、91%。水力沖擊試驗(yàn)證明,MBR有良好的耐水力沖擊能力,是一種較好的富集Anammox菌的裝置。

2)在MBR中,普通厭氧顆粒污泥經(jīng)過100多天馴化,變?yōu)榱郊性?.2～1 mm的Anammox顆粒污泥。通過分批培養(yǎng)試驗(yàn)證明,顆粒污泥是MBR中起Anammox功能的重要承載者。

3)T-RFLP試驗(yàn)證明,微生物群落結(jié)構(gòu)運(yùn)行前后發(fā)生明顯變化,運(yùn)行后整個反應(yīng)器中適應(yīng)厭氧氨氧化運(yùn)行方式的菌種增殖較多,包括planctomyce、pirellula、gemmata、pseudomonas等。

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(責(zé)任編輯:李春麗)

Operation Characterictics and Microbial Community Distribution of Anammox in a Membrane Bioreactor

LU Qing1, HUA Zhao-Zhe＊2, LI Xiu-Fen1, GE Fu-Qing1, DU Guo-Cheng1, CHEN Jian2
(1.School of Environmental&Civil Engineering,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2.Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

The operation characteristics and microbial community distribution of Anammox process in the MBR was studied in this manuscript.Seeding with synthetic media,we found that the granular sludge with 0.2～1 mm diameter was obtained successfully.The nitrogen-loading rate amounted to 0.245 kgTN/(m3·d),and the removal efficiency of total nitrogen,N H4+-N and NO2--N was 80%,81%and 91%,respectively.Experiencing the hydraulic shock text,the HRT of MBR was gradually shorted from 14 to 7.9 h,the NH4+-N and NO2--N removal efficiencies were kept at about 75%and 85%,respectively.Based on terminal restriction fragment length polymorphism(T-RFLP)analysis,Microbial community diversity was achieved, and the predominant populations ofAnammox bacteria found inMBRsystem were theplanctomyce,pirellula,gemmata,pseudomonas after enrichment.The results presented here provided a theoretical basis for the change of microbial community during Anammox process.

membrane bioreactor,anaerobic ammonia oxidation,granular sludge,microbial community distribution

X 703.1

:A

1673-1689(2010)04-0581-08

2009-04-15

國家973計劃項(xiàng)目(2007CB 714036);江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(BK2007022);江蘇省太湖水專項(xiàng)項(xiàng)目(BS2007125)。

＊通信作者:華兆哲(1969-),男,江蘇無錫人,工學(xué)博士,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事環(huán)境生物技術(shù)方面研究。Email:huazz@jiangnan.edu.cn。