李艷蕊 ，李學(xué)伍 ，王 麗，劉 磊，張改平

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，甘肅 蘭州 730070；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)部動物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南省動物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002）

豬瘟（classical swine fever，CSF）是由豬瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）引起豬的一種以高熱和出血為特征的高度接觸性傳染病，是危害養(yǎng)豬業(yè)的重大傳染病之一，被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列入A類疾病名錄[1]，我國也將豬瘟列為一類動物疫病。CSFV是黃病毒科（Flaviviridae）瘟病毒屬（Pestivirus）的成員，其基因組為長約12.3 kb的線狀單股正鏈RNA，含有單一的開放閱讀框架（ORF），編碼3 898個氨基酸殘基，有4種結(jié)構(gòu)蛋白（衣殼蛋白C和囊膜糖蛋白Erns、E1、E2）以及8種非結(jié)構(gòu)蛋白（Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和 NS5B）[2-3]。其中 Erns、E2 是病毒誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的兩個主要保護(hù)性抗原，同時也是病毒吸附進(jìn)入敏感細(xì)胞的必須蛋白。Erns不具有跨膜區(qū)，而是以一種未知機(jī)制連接在病毒粒子表面，本身既是包膜結(jié)構(gòu)蛋白，又是一種核苷酸酶[4]。盡管針對Erns的單抗也能中和病毒，但Erns在天然宿主中的體液免疫保護(hù)作用機(jī)制仍不清楚[5-6]。目前，國內(nèi)外完成的對豬瘟病毒的研究主要集中在應(yīng)用不同的載體來表達(dá)E2蛋白作為診斷及免疫[7]，而Erns應(yīng)用研究則相對較少。

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是目前比較成熟的真核表達(dá)系統(tǒng)之一，本研究通過畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)對CSFV Erns蛋白進(jìn)行體外重組，旨在為研制以此蛋白為診斷抗原的CSFV ELISA定型診斷試劑盒奠定基礎(chǔ)。同時對于研究CSFV的結(jié)構(gòu)與功能也有重要的作用。

1 材料與方法

1.1 菌種及質(zhì)粒

E.coli JM109、P.pastoris GS115和 P.pastoris整合型分泌表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)部動物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試劑及工具酶

酵母完全培養(yǎng)基（YPD）、選擇培養(yǎng)基（MD）、甲醇選擇培養(yǎng)基（MM）、誘導(dǎo)培養(yǎng)基（BMGY）和甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)基（BMMY）按Invitrogen公司說明書配制；Plasmid Miniprep kit和 Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0以及各種限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、NotⅠ、SalⅠ和 T4 DNA 連接酶、Ex taq 酶購自TaKaRa公司；Tryptone、Yeast為OXOID產(chǎn)品；YNB為Solarbio產(chǎn)品；

DL2000 DNA Marker、λ-EcoT14 Idigest Marker、λ-Hind Ⅲdigest Marker、低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)Marker購自TaKaRa公司；四甲基氨基甲烷（TEMED）、D-山梨醇等購自Promega公司；過氧化物酶標(biāo)記的二抗等為Sigma公司產(chǎn)品；所用引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 引物的設(shè)計及合成

根據(jù)GenBank中登錄的豬瘟Erns基因序列，設(shè)計合成特異性引物，并在5′端加EcoRⅠ位點(diǎn)，3′端加 NotⅠ位點(diǎn)。引物序列如下：Erns 5′：5′-GGGGTACCGAGATAAAAGTTAATCCTCCTCAG-3′（引入EcoRⅠ酶切位點(diǎn)及保護(hù)性堿基），Erns 3′：5′-CCCAAGCTTCTATCCATG GACTTTG-3′（引入NotⅠ酶切位點(diǎn)及保護(hù)性堿基）；根據(jù)甲醇酵母乙醇氧化酶1（AOX1）基因兩端序列設(shè)計的引物序列如下 ：5′AOX1：5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC －3′；3′AOX1：5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′。引物由上海生工生物制品公司合成。

1.4 PCR擴(kuò)增Erns基因及基因片段的回收

以Teasy-Erns質(zhì)粒為模板，PCR反應(yīng)條件如下94℃ 2 min；94℃ 1 min，50℃ 1 min，72℃ 1 min，共30個循環(huán)；72℃延伸10min。4℃保存PCR產(chǎn)物，并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。從瓊脂糖凝膠中切下目的Erns片段，用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0試劑盒回收。

1.5 p PIC9 K-Erns重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

將Erns基因及pPIC9K質(zhì)粒載體均用EcoRⅠ酶和NotⅠ酶雙切，瓊脂糖電泳，回收酶切片段；將雙切后的Erns基因片段及pPIC9K片段用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli JM109（AMP+），用含 AMP+的 LB 平板篩選陽性重組子。通過酶切、PCR和測序等方法鑒定陽性克隆，命名為pPIC9K-Erns。

1.6 電穿孔轉(zhuǎn)化及PCR方法篩選重組子

將重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-Erns和空質(zhì)粒p PIC9 K 用 SalⅠ酶切線性化，在 1.5 kV、20 μF、400 Ω的條件下將其轉(zhuǎn)化到Pichi apastoris GS115酵母感受態(tài)中，取400μL鋪于MD平板上，28℃培養(yǎng)3 d。挑選生長良好的單菌落接種于2 mL YPD培養(yǎng)過夜后，取新鮮的菌液3μL進(jìn)行PCR[8]，所用引物為 5′AOX1：5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′；3′AOX1：5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′。

1.7 His+Mut+和His+Muts表型的鑒別

挑取篩選到的重組子單菌落分別接種MD和MM平板，28℃培養(yǎng)3 d。在2種平板上均生長良好的菌落為His+Mut+表型菌落。在MD平板上生長迅速，而在MM平板上生長較緩慢的即為His+Muts表型菌株。

1.8 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

選取PCR鑒定正確的重組菌接種至含10 mL YPD培養(yǎng)基（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖）的試管中，30℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜；次日以1%的比例（V∶V）接種至含100mLBMGY培養(yǎng)基（1.34%YNB、4×10-7生物素、10%甘油、1% 酵母提取物、2%蛋白胨、5%甘油）的500 mL三角瓶中，30℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)約24 h；離心并將菌體重懸于 BMMY 培養(yǎng)基（1.34%YNB、4×10-7生物素、1%酵母提取物、2%蛋白胨、0.5%甲醇）中，28℃，200 r/min振蕩誘導(dǎo)表達(dá)4 d，每隔24 h補(bǔ)加100%甲醇至終濃度為0.5%，按時間段取樣進(jìn)行分析。

1.9 外源基因表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

將工程酵母菌在BMMY培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)一定時間后，離心分別收集沉淀和上清，并將培養(yǎng)上清用硫酸銨沉淀法初步純化，用2倍上樣緩沖液與沉淀和純化的上清蛋白等量混合進(jìn)行SDS-PAGE試驗(yàn)以分析目的蛋白的表達(dá)。

1.10 蛋白印跡（Western-blot）檢測

將SDS-PAGE的電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂乳封閉。分別用CSFV陽性豬血清、原核表達(dá)Erns蛋白單抗作為一抗，進(jìn)行Western-blot檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 Erns基因擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，得到約681 bp左右的條帶（圖1）。

圖1 PCR擴(kuò)增Erns基因

2.2 pPIC9K-Erns陽性重組質(zhì)粒的篩選

將雙酶切后的目的片段和表達(dá)載體片段連接后轉(zhuǎn)化E.coli JM109，在含有AMP+的LB平板上隨機(jī)挑取5個菌落直接進(jìn)行PCR，電泳顯示菌落2、4、5、6有與目的基因相符的條帶，1為陰性對照，說明 2、4、5、6 可能為陽性重組子（圖 2）。

圖2 重組質(zhì)粒特異性引物PCR鑒定

選兩個提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，電泳結(jié)果顯示2有兩個條帶，其一為載體片段（約9 kp左右），其二為與目的基因相符的條帶（681 bp），而1則為假陽性質(zhì)粒（圖3），將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒送上海生工生物制品公司測序，結(jié)果證明Erns基因已正確插入pPIC9 K的多克隆位點(diǎn)上。

圖3 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定

2.3 pPIC9K-Erns重組酵母菌株的篩選及PCR鑒定

DNA測序結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pPIC9K-Erns序列和讀碼框架皆正確。pPIC9K-Erns經(jīng)SalⅠ酶切線性化后，轉(zhuǎn)化Pichia p astoris GS115酵母感受態(tài)細(xì)胞，在MD平板上長出19個His+轉(zhuǎn)化子，小量培養(yǎng)后，提取基因組DNA，同時提取空白對照GS115 的基因組，作為模板，以 5′AOX1 和 3′AOX1為引物進(jìn)行PCR，電泳檢測在1 173 bp左右有條帶出現(xiàn)，與 Erns基因（681 bp）加載體序列（492 bp）的大?。? 173 bp）相當(dāng)，同時以設(shè)計的其自身引物Erns 5′和Erns 3′為引物，得到與目的基因相符條帶（681 bp），表明pPIC9K-Erns已整合進(jìn)酵母染色體中。對陽性菌株用MM和MD培養(yǎng)基鑒定其表型，結(jié)果均為 His+Mut＋。

圖4 重組酵母的PCR鑒定

2.4 Erns基因表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析及Western-blot檢測

將篩選的轉(zhuǎn)化子分別接種BMGY和BMMY培養(yǎng)基誘導(dǎo)表達(dá)后，將表達(dá)上清透析、濃縮后進(jìn)行SDS-PA GE。結(jié)果顯示，GS115/p PIC9K-Erns轉(zhuǎn)化子3和4的誘導(dǎo)產(chǎn)物在50 kD處出現(xiàn)與預(yù)計的以同源二聚體形式存在的Erns大小相符的條帶（見圖5），而1和2及陰性對照5則沒有這一條帶。

圖5 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳及Western-blot分析

Western-blot結(jié)果顯示（見圖5），重組蛋白Erns可被CSFV多抗血清識別（第6條帶），而陰性對照則不顯色（第7條帶）。證明本試驗(yàn)所得的表達(dá)產(chǎn)物可檢測CSFV的抗體。

3 討 論

表達(dá)系統(tǒng)是基因工程及生物制藥研究和應(yīng)用的重要工具，要求其經(jīng)濟(jì)、高效，并且安全。巴斯德畢赤酵母（Picha pastoris）作為甲醇營養(yǎng)型酵母的一種，能夠在以甲醇作為單一碳源的培養(yǎng)基上生長，既具有原核生物易于培養(yǎng)、繁殖快、便于基因工程操作的特點(diǎn)，又具有真核生物的蛋白質(zhì)加工、折疊、翻譯后修飾的優(yōu)點(diǎn)，同時其遺傳比較穩(wěn)定、能夠高密度發(fā)酵、蛋白的表達(dá)量高、且易于純化，因此，畢赤酵母現(xiàn)已成為現(xiàn)代分子生物學(xué)研究最重要的工具和模型，是表達(dá)外源基因比較理想的宿主[9-10]。目前已有400多種外源蛋白在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)[11-12]，該系統(tǒng)是目前最成功的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)之一。

豬瘟病毒的結(jié)構(gòu)蛋白為C和包膜糖蛋白Erns、E1、E2。除Erns、E2蛋白外，豬瘟的其他任何結(jié)構(gòu)蛋白均不能產(chǎn)生中和抗體[13]。Erns由227個氨基酸殘基（Glu268-Ala494）組成，以分子質(zhì)量為97 ku的同源二聚體存在。Erns可誘導(dǎo)產(chǎn)生豬瘟的中和抗體，免疫豬可誘導(dǎo)產(chǎn)生對致死量CSFV的保護(hù)性免疫[14]。此外，編碼Erns的核酸比E2保守性更高，因而其不僅可作為防控豬瘟的一種靶蛋白，也可配合E2亞單位疫苗免疫的檢測來區(qū)分自然感染或人工免疫，開發(fā)應(yīng)用前景比較好。余興龍等用大腸埃希菌表達(dá)的CSFV重組E2蛋白為抗原，建立了檢測CSFV抗體的間接EL ISA方法[15]。韓雪清、滿朝來等人均建立了E2蛋白的酵母表達(dá)株，獲得了比較大的表達(dá)產(chǎn)量，并對其表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化[16-17]。Erns目前的表達(dá)均集中于原核，其表達(dá)量較小，且不能進(jìn)行后加工，難以進(jìn)行進(jìn)一步分析。

本研究通過構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9K-Erns，成功轉(zhuǎn)化和篩選到兩株多拷貝的工程酵母菌株，通過甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)分泌表達(dá)的Erns蛋白量很高，并且pPIC9K載體表達(dá)蛋白帶有His標(biāo)簽，為后期的親和層析純化蛋白創(chuàng)造了有利條件。Western-blot分析結(jié)果表明，表達(dá)的Erns蛋白能識別天然豬瘟多克隆抗體，具有生物學(xué)活性，下一步試驗(yàn)將大量誘導(dǎo)表達(dá)Erns蛋白，收集表達(dá)產(chǎn)物，經(jīng)過變性、復(fù)性和純化，以期得到高產(chǎn)量的純化Erns蛋白，進(jìn)一步研究Erns蛋白的功能與結(jié)構(gòu)。

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