王子輝 楚 杰 王君高 劉可春

布拉酵母菌(Saccharomyces boulardii)是在印尼荔枝中分離得到的一種適溫的、非毒性酵母菌,是釀酒酵母的亞種,曾被廣泛應(yīng)用于人類抗擊腹瀉的藥物中，它能很有效的治療腸道的各種炎癥，在治療腸炎和細(xì)菌引起的腹瀉方面療效十分顯著。其制劑應(yīng)用于畜牧業(yè),可有效降低病原菌和其毒素的濃度,并能加強(qiáng)微生態(tài)平衡,刺激免疫系統(tǒng),作為飼料添加劑的應(yīng)用已得到包括中國、歐盟在內(nèi)的世界上許多國家的認(rèn)可。最新研究結(jié)果表明,布拉酵母菌還能抑制大腸桿菌內(nèi)毒素的毒性作用,降低腸道內(nèi)大腸桿菌數(shù)量,有望用于防治雞大腸桿菌病;布拉酵母菌作為一種新型微生態(tài)制劑,在畜牧業(yè)中必將有廣闊的應(yīng)用前景。但在布拉酵母菌的研究中，我們發(fā)現(xiàn)其抗逆性能力差，在后期制備活菌制劑過程中，死亡率較高，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，海藻糖對其有神奇的保護(hù)作用。

海藻糖是一種非還原性的二糖,廣泛的存在于酵母菌、真菌、動植物體內(nèi),可以非常有效地保護(hù)生物膜和生物大分子,從而避免細(xì)胞受到干燥、冷凍和滲透壓巨變造成的傷害,具有“生命之糖”的稱號。酵母細(xì)胞內(nèi)海藻糖的含量是由合成和分解的平衡調(diào)節(jié)決定,這種平衡調(diào)節(jié)隨著生長周期、營養(yǎng)和環(huán)境條件而發(fā)生變化。本試驗(yàn)通過培養(yǎng)基成分對布拉酵母菌生物量及海藻糖積累的影響，確定其最佳用量以提高布拉酵母菌生物量及海藻糖的含量，從而提高布拉酵母菌的成活率。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 主要材料

布拉酵母菌（本實(shí)驗(yàn)室保藏）、三氯乙酸、36%鹽酸、乳糖、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、尿素、酵母膏、蛋白胨、檸檬酸三銨、磷酸氫二銨、蛋白胨、瓊脂粉、玉米漿等。

1.1.2 主要儀器

SBA-40C型葡萄糖生物傳感器（山東省科學(xué)院生物研究所研制）、超聲波細(xì)胞破碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）、水浴鍋、搖床、烘箱。

1.1.3 種子培養(yǎng)

以7%的葡萄糖為碳源，0.7%的磷酸氫二銨為氮源，1.0%的玉米漿為生長因子，0.2%的磷酸二氫鉀為無機(jī)鹽配制種子培養(yǎng)基，500 ml三角瓶裝量100 ml，滅菌后無菌條件下挑取三環(huán)布拉酵母菌種接入種子培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)16 h備用。

1.1.4 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

發(fā)酵培養(yǎng)基同1.1.3節(jié)，將種子培養(yǎng)液按10%的接種量接種于發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)18 h。

1.1.5 生物量的測定

將1.1.4節(jié)中發(fā)酵液5000 r/min離心10 min，收集菌體，用生理鹽水洗滌兩遍，稱重。

1.1.6 布拉酵母菌海藻糖提取及含量測定方法

以5%的三氯乙酸做提取劑，超聲破碎10 min后100℃水浴30 min得上清液。然后將提取液用5%鹽酸在100℃下水解5 h，用生物傳感器測定葡萄糖含量，得海藻糖含量。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基成分對布拉酵母菌生物量及海藻糖含量積累的影響

1.2.1.1 碳源對布拉酵母菌生物量及海藻糖含量積累的影響

取4個(gè)500 ml的三角瓶，分別以7%的乳糖、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖為碳源，其余同1.1.3配制液體培養(yǎng)基150 ml，滅菌后將1.1.3節(jié)中培養(yǎng)好的種子液按10%的接種量接入4個(gè)三角瓶中，30℃、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)18 h，按1.1.5節(jié)及1.1.6節(jié)方法測定生物量及海藻糖含量。

1.2.1.2 碳源濃度對布拉酵母菌生物量及海藻糖含量積累的影響

取4個(gè)500 ml的三角瓶，分別以7%、10%、12%、15%的葡萄糖為碳源，其余同1.1.3節(jié)配制液體培養(yǎng)基150 ml，滅菌后將1.1.3節(jié)中培養(yǎng)好的種子液按10%的接種量接入4個(gè)三角瓶中，30℃、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)18 h，按1.1.5節(jié)及1.1.6節(jié)方法測定生物量及海藻糖含量。

1.2.1.3 氮源對布拉酵母菌生物量及海藻糖含量積累的影響

取4個(gè)500 ml的三角瓶，分別以0.7%的檸檬酸三銨、尿素、酵母膏、磷酸氫二銨為氮源，其余同1.1.3節(jié)，配制液體培養(yǎng)基150 ml，滅菌后將1.1.3節(jié)中培養(yǎng)好的種子液按10%的接種量接入4個(gè)三角瓶中，培養(yǎng)18 h，按1.1.5節(jié)及1.1.6節(jié)方法測定生物量及海藻糖含量。

1.2.1.4 氮源濃度對布拉酵母菌生物量及海藻糖含量積累的影響

取4個(gè)500 ml的三角瓶，分別以0.5%、0.7%、1.0%、1.2%的檸檬酸三銨為氮源，其余同1.1.3節(jié)配制液體培養(yǎng)基150 ml，滅菌后將1.1.3節(jié)中培養(yǎng)好的種子液按10%的接種量接入4個(gè)三角瓶中，30℃、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)18 h，按1.1.5節(jié)及1.1.4節(jié)方法測定生物量及海藻糖含量。

1.2.1.5 玉米漿含量對布拉酵母菌生物量及海藻糖含量積累的影響

取4個(gè)500 ml的三角瓶，分別以0.7%的檸檬酸三銨為氮源，1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的玉米漿為生長因子，其余同1.1.3節(jié)配制液體培養(yǎng)基150 ml，滅菌后將1.1.3節(jié)中培養(yǎng)好的種子液按10%的接種量接入4個(gè)三角瓶中，30℃、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)18 h，按1.1.5節(jié)及1.1.6節(jié)方法測定生物量及海藻糖含量。

1.2.1.6 磷酸氫二鉀濃度對布拉酵母菌生物量及海藻糖含量積累的影響

取4個(gè)500 ml的三角瓶，分別以 0.1%、0.2%、0.3%、0.5%的磷酸二氫鉀為無機(jī)鹽，其余同1.1.3配制液體培養(yǎng)基150 ml，滅菌后將1.1.3節(jié)中培養(yǎng)好的種子液按10%的接種量接入4個(gè)三角瓶中，30℃、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)18 h，按1.1.5節(jié)及1.1.6節(jié)方法測定生物量及海藻糖含量。

1.2.2 正交試驗(yàn)

分別以葡萄糖、檸檬酸三銨、玉米漿、磷酸二氫鉀為因素，每個(gè)因素設(shè)置3個(gè)水平，以海藻糖和菌體生物量為考察指標(biāo)，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)（見表1），根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果優(yōu)化布拉酵母菌細(xì)胞內(nèi)海藻糖富集和菌體生長的培養(yǎng)基。

表1 培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平（%）

1.2.3 優(yōu)化前后布拉酵母菌生物量及海藻糖含量的比較試驗(yàn)

取12個(gè)500 ml的三角瓶，其中6個(gè)按葡萄糖7%、磷酸氫二銨0.7%、玉米漿1.0%、磷酸二氫鉀0.2%配制液體培養(yǎng)基，每瓶150 ml；另外6個(gè)按葡萄糖10%、檸檬酸三銨0.7%、玉米漿1.5%、磷酸二氫鉀0.2%配制液體培養(yǎng)基，每瓶150 ml；滅菌后將1.1.3節(jié)中培養(yǎng)好的種子液按10%的接種量接入各三角瓶中，30 ℃、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)，分別在 14、16、18、20、22、24 h取樣，按1.1.5節(jié)及1.1.6節(jié)方法測定生物量及海藻糖含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 培養(yǎng)基成分對布拉酵母菌生物量及海藻糖含量積累的影響

2.1.1 碳源對布拉酵母菌生物量及海藻糖含量積累的影響（見圖1）

圖1 碳源對布拉酵母菌生物量及海藻糖含量積累的影響

由圖1可以看出，乳糖和麥芽糖為碳源時(shí)，布拉酵母菌的生物量不高，雖然測定所得的海藻糖含量比較高，但因發(fā)酵過程中乳糖和麥芽糖先通過滲透作用進(jìn)入布拉酵母細(xì)胞內(nèi)，有部分還沒有被菌體利用，而乳糖和麥芽糖都含有一分子的葡萄糖，測定過程中不能排除是酵母細(xì)胞中未洗凈的殘留糖類干攏；而蔗糖和葡萄糖為碳源時(shí)比較利于布拉酵母菌生物量的增長，但蔗糖所培養(yǎng)的酵母中海藻糖含量較低，且成本較高，研究表明，海藻糖是由UDP-葡萄糖和6－P-葡萄糖兩步反應(yīng)形成，因此，葡萄糖是海藻糖合成的最初底物，且葡萄糖價(jià)格低廉，故后續(xù)試驗(yàn)中選擇葡萄糖做碳源。

2.1.2 碳源濃度對布拉酵母菌生物量及海藻糖含量積累的影響（見圖2）

由圖2可以看出，布拉酵母菌體內(nèi)的海藻糖含量隨著葡萄糖濃度的增加而升高，生物量及海藻糖含量在葡萄糖濃度為10%時(shí)達(dá)到最大，并隨濃度的增加而趨平緩，仔細(xì)觀察圖的走向可以看出葡萄糖濃度由10%增加為15%時(shí)，生物量及海藻糖含量基本維持在相對平衡的水平，故培養(yǎng)基中葡萄糖濃度選定在10%。

圖2 碳源濃度對布拉酵母菌生物量及海藻糖含量積累的影響

2.1.3 氮源對布拉酵母菌生物量及海藻糖含量積累的影響（見圖3）

圖3 氮源對布拉酵母菌生物量及海藻糖含量積累的影響

由圖3可以看出，檸檬酸三銨和酵母膏為氮源時(shí)，比較適合布拉酵母菌生物量的增長，二者生物量相差無幾，但檸檬酸三銨為氮源時(shí)所得酵母中海藻糖含量明顯高于酵母膏為氮源時(shí)的含量，并且檸檬酸三銨價(jià)格便宜，比較有益于工業(yè)生產(chǎn)，故后續(xù)試驗(yàn)中選檸檬酸三銨作為氮源。

2.1.4 氮源濃度對布拉酵母菌生物量及海藻糖含量積累的影響（見圖4）

圖4 氮源濃度對布拉酵母菌生物量及海藻糖含量積累的影響

由圖4可以看出，檸檬酸三銨濃度為0.70%時(shí)所得布拉酵母菌的生物量最大，且海藻糖含量較高，故后續(xù)試驗(yàn)中，培養(yǎng)基中氮源濃度選擇在0.70%。

2.1.5 玉米漿濃度對布拉酵母菌生物量及海藻糖含量積累的影響（見圖5）

圖5 玉米漿濃度對布拉酵母菌生物量及海藻糖含量積累的影響

由圖5可以看出，在玉米漿濃度為1.5%時(shí)比較適合布拉酵母菌海藻糖的積累，生物量雖不是最高，但也和最大值相差甚微，故在后續(xù)試驗(yàn)中玉米漿的濃度選擇在1.5%～2.0%。

2.1.6 磷酸氫二鉀濃度對布拉酵母菌生物量及海藻糖含量積累的影響（見圖6）

圖6 磷酸氫二鉀濃度對布拉酵母菌生物量及海藻糖含量積累的影響

由圖6可以看出，在磷酸二氫鉀濃度為0.20%時(shí),既比較適合布拉酵母菌生物量的增長，同時(shí)酵母中海藻糖含量相比其它幾個(gè)濃度也達(dá)到最高，故本試驗(yàn)無機(jī)鹽磷酸二氫鉀的濃度選擇在0.20%。

2.2 正交試驗(yàn)

由表2可以看出,葡萄糖、檸檬酸三銨、玉米漿、磷酸二氫鉀對菌體生物量積累的影響主次為：葡萄糖＞檸檬酸三銨＞磷酸二氫鉀＞玉米漿；對海藻糖積累的影響主次為：葡萄糖＞玉米漿＞磷酸二氫鉀＞檸檬酸三銨,綜合兩個(gè)指標(biāo)可得出最佳的條件組合為A2B2C1D2,即10%的葡萄糖、0.7%的檸檬酸三銨、1.5%的玉米漿、0.2%的磷酸氫二鉀。

表2 培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3 優(yōu)化前后布拉酵母菌生物量及海藻糖含量的比較試驗(yàn)（見圖 7、圖 8）

圖7 培養(yǎng)基優(yōu)化前后菌體質(zhì)量對比

圖8 培養(yǎng)基優(yōu)化前后海藻糖含量對比

由圖7、8可以看出，優(yōu)化后的培養(yǎng)基無論在生物量增長，還是海藻糖含量的積累都明顯優(yōu)于優(yōu)化之前培養(yǎng)基，分別提高 34%（優(yōu)化前：6.2 g；優(yōu)化后：8.3 g）和 30%（優(yōu)化前：43.5 mg/dl；優(yōu)化后：56.6 mg/dl）。并且18 h是布拉酵母菌生物量及海藻糖含量的最佳積累點(diǎn)。

3 結(jié)論

3.1 本試驗(yàn)通過培養(yǎng)基成分對布拉酵母菌菌體中海藻糖積累和布拉酵母菌生物量的影響，摸索出既利于菌體生長，又利于菌體中海藻糖積累的培養(yǎng)基配方：10%的葡萄糖、0.70%的檸檬酸三銨、1.5%的玉米漿、0.20%的磷酸氫二鉀。優(yōu)化后的培養(yǎng)基布拉酵母菌的生物量比優(yōu)化前提高了約34%，菌體中海藻糖含量比優(yōu)化前提高了約30%。

3.2 由于布拉酵母菌制劑應(yīng)用于畜牧業(yè),可有效降低病原菌含量和其毒素的濃度，并能加強(qiáng)微生態(tài)平衡,刺激免疫系統(tǒng)，故其菌體作為飼料添加劑，必將有廣闊的應(yīng)用前景，且優(yōu)化后培養(yǎng)基配方中的碳源、氮源等價(jià)格都比較低廉，故此培養(yǎng)基用于工業(yè)生產(chǎn)布拉酵母菌活菌制劑，不僅能節(jié)約成本，而且能提高產(chǎn)品產(chǎn)量。優(yōu)化后的培養(yǎng)基在布拉酵母菌海藻糖積累方面有一定增加，對布拉酵母菌后期制備過程中有一定的保護(hù)作用。

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