邢春芳 葛向陽(yáng)

胰蛋白酶抑制劑是豆粕中重要的抗?fàn)I養(yǎng)因子之一。主要包括兩大類：Kunitz類和Bowman-Birk類，它們?cè)诶砘再|(zhì)上存在一定的差異，但是兩類胰蛋白酶抑制劑都可以和動(dòng)物體內(nèi)的胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶結(jié)合，抑制其活性，最終導(dǎo)致消化不良，阻礙動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育。

目前胰蛋白酶抑制劑檢測(cè)方法很多：脲酶檢測(cè)法、氫氧化鉀檢測(cè)法、酶化學(xué)方法、免疫學(xué)方法等，其中脲酶檢測(cè)法和氫氧化鉀檢測(cè)法都是間接的檢測(cè)胰蛋白酶抑制劑的含量。最經(jīng)典的檢測(cè)方法是Kakade酶化學(xué)方法，此方法是用反應(yīng)中被抑制的胰蛋白酶的活性反映胰蛋白酶抑制劑的含量。該方法簡(jiǎn)單易操作，但靈敏度低，結(jié)果變異性較大，而且在檢測(cè)發(fā)酵豆粕時(shí)，反應(yīng)過(guò)程中易形成白色絮狀物，使后續(xù)的比色過(guò)程無(wú)法進(jìn)行，檢測(cè)不能完成。為了解決這一問(wèn)題，本文建立了間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

主要儀器：96孔酶標(biāo)板（JET，加拿大制造）；酶標(biāo)儀（BIO-TEK，美國(guó)制造）；水浴鍋（富華，中國(guó)制造）。

主要試劑：大豆胰蛋白酶抑制劑標(biāo)準(zhǔn)品（sigma，美國(guó)）；抗胰蛋白酶抑制劑抗體（自己制備），HRP-羊抗兔 IgG（BOSTER，中國(guó)）；包被液：0.05 M pH 值 9.6碳酸鹽緩沖液，4℃保存；洗滌緩沖液：0.15 M pH值7.40磷酸鹽緩沖液，4℃保存；封閉液：1%BSA，現(xiàn)用現(xiàn)配；底物緩沖液：pH值5.0磷酸檸檬酸緩沖液；底物：臨用前配制，1 ml TMB（10 mg TMB/5 ml無(wú)水乙醇），15 ml底物緩沖液，64 μl 30%雙氧水；終止液：2 M硫酸。

1.2 間接ELISA基本程序

按照岳磊等（2008）介紹的方法進(jìn)行ELISA操作，測(cè)定OD450nm值，每個(gè)步驟之間均用洗滌液洗滌3次，每次 5 min，根據(jù) Amax、IC50、Amax/IC50確定 ELISA 最佳反應(yīng)條件。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

1.3.1 包被抗原和一抗、二抗工作濃度的確定

用方陣滴定法進(jìn)行測(cè)定，選擇OD450nm值在1.0左右對(duì)應(yīng)的包被抗原和一抗、二抗的濃度為ELISA反應(yīng)的理想工作濃度。

1.3.2 抗原最佳包被時(shí)間的選擇

以上面得到的抗原的最佳包被工作濃度，按37℃1、2、3、4、5 h和4℃過(guò)夜進(jìn)行包被，以最佳抗血清稀釋度進(jìn)行ELISA測(cè)定，測(cè)OD450nm選擇最佳包被時(shí)間。

1.3.3 封閉液濃度和封閉時(shí)間的選擇

以濃度為0.5%、1%、1.5%、2%的BSA進(jìn)行封閉，選擇最佳封閉液濃度。然后以最佳封閉液濃度在37℃分別封閉 1、2、3和 4 h，測(cè)OD450nm選擇最佳封閉時(shí)間。

1.3.4 抗原和抗體體積比及競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間的選擇

以抗原和抗體體積比 70：30、60：40、50：50、40：60、30：70進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，測(cè)OD450nm選擇最佳體積比。以抗原和抗體最佳體積比，37℃按45、60、75、90 min進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，測(cè)OD450nm選擇最佳競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間。

1.3.5 酶標(biāo)二抗作用時(shí)間的選擇

以酶標(biāo)二抗最佳稀釋度按 45、60、75、90 min進(jìn)行反應(yīng)，測(cè)OD450nm選擇最佳作用時(shí)間。

1.3.6 顯色液中TMB比例的選擇

TMB與底物緩沖液的體積比按 1：10、1：15、1：20、1：25進(jìn)行顯色反應(yīng)，測(cè)OD450nm選擇最佳體積比。

1.3.7 顯色時(shí)間的選擇

加入底物后，37 ℃顯色 10、15、20、25 min，測(cè)OD450nm選擇最佳顯色時(shí)間。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

根據(jù)上述優(yōu)化的最佳條件，進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。以系列稀釋度（16、4、1、1/4、1/8、1/16 μg/ml）的 TI標(biāo)準(zhǔn)液建立測(cè)定梯度，測(cè) OD450nm。抑制率I（%）=100×[(OD對(duì)照-ODTI)/(OD對(duì)照-OD空白)]，以抑制率I為縱坐標(biāo)，TI的濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程。計(jì)算IC50和IC15，對(duì)其進(jìn)行相關(guān)分析。

1.5 抗體特異性檢測(cè)

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，分別考察了抗胰蛋白酶抑制劑的抗體與豆粕中其他主要的抗?fàn)I養(yǎng)因子Glycinin與β-Conglycinin的交叉反應(yīng)，以抗體稀釋度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，OD450nm為縱坐標(biāo)作圖反應(yīng)抗體的特異性。

1.6 精密度的測(cè)定

以批內(nèi)誤差和批間誤差來(lái)表示該方法的精密度。TI的每一標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度在同一塊板內(nèi)作6次重復(fù)，計(jì)算孔間變異系數(shù)表示批內(nèi)誤差；用同等質(zhì)量的不同酶標(biāo)板重復(fù)操作6次，計(jì)算批間變異系數(shù)表示批間誤差。

1.7 樣品的前處理

考察不同浸提液對(duì)樣品的提取效果，所用浸提液有0.05 M pH值8.2 Tris-HCl，0.01 M NaOH（加入豆粕樣品后調(diào)pH值9.5）；pH值7.34 PBS、蒸餾水。稱取豆粕樣品0.5 g，加入25 ml浸提液，25℃振蕩30 min，8000 r/min離心10 min，取上清適度稀釋后按優(yōu)化好的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行ELISA分析。

1.8 回收率的測(cè)定

在空白樣品（經(jīng)高溫120℃處理30 min作為空白樣）中分別添加濃度為 0.8、1.6、2.4 μg/ml的 TI，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行，用上述建立的方法進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 ELISA方法的建立

經(jīng)過(guò)優(yōu)化后：在96孔酶標(biāo)板上用包被液包被標(biāo)準(zhǔn)抗原（0.5 μg/ml），4 ℃過(guò)夜。用 PBST 洗板，1%BSA封閉液封板，37℃2 h，棄封閉液，PBST洗板。加梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)抗原、適度稀釋的樣品液和一抗（1：800），37℃孵育75 min。洗板后加二抗，37℃孵育75 min。洗板后加底物液，37℃反應(yīng)15 min。加終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀讀數(shù)。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1，得到的線性方程為y=16.18x+57.183（R2=0.9986）。

圖1 TI標(biāo)準(zhǔn)曲線

在ELISA中，常用IC50（抗原抗體結(jié)合反應(yīng)被抑制一半時(shí)抗原的濃度）表示靈敏度，IC50愈小，靈敏度愈高。最低檢出限則由IC15來(lái)表示，即抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的抑制率為15%時(shí)所對(duì)應(yīng)的抗原濃度。本實(shí)驗(yàn)建立的ELISA方法的靈敏度IC50為0.36 μg/ml，最低檢出限 IC15為 2 ng/ml。

2.3 抗體特異性檢測(cè)

測(cè)定結(jié)果如圖2所示，Glycinin與β-Conglycinin抗原蛋白隨著抗體稀釋度的增加所對(duì)應(yīng)的OD值變化很小，而且值很小。而TI隨著抗體稀釋度的增加所對(duì)應(yīng)的OD值呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢(shì)。這說(shuō)明實(shí)驗(yàn)中所用的抗TI抗體具備顯著的特異性。

2.4 精密度的測(cè)定

通過(guò)批內(nèi)、批間變異系數(shù)的計(jì)算考察了實(shí)驗(yàn)的精密度。表1顯示了線性范圍內(nèi)各個(gè)梯度濃度的批內(nèi)變異系數(shù)為3.49%～18.77%，批間變異系數(shù)為4.55%～24.96%。

圖2 抗體特異性

表1 不同TI濃度的變異系數(shù)

2.5 樣品的前處理

在間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA中，OD值越小TI含量越高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3，0.05 M pH值8.2 Tris-HCl浸提效果最好。

圖3 不同浸提液的浸提效果

2.6 回收率的測(cè)定

在樣品中添加濃度為 0.8、1.6、2.4 μg/ml的胰蛋白酶抑制劑，表2顯示平均回收率依次為99.2%、93.7%、104.9%，所得樣品添加的回收率都比較高，表明該實(shí)驗(yàn)建立的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法符合實(shí)際。

表2 樣品添加的回收率

3 結(jié)論

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)由于靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)已經(jīng)在飼料檢測(cè)中獲得了廣泛的應(yīng)用，但ELISA測(cè)定中影響因素較多。首先，酶標(biāo)板的質(zhì)量對(duì)測(cè)定結(jié)果有很大的影響，不同廠家、不同批次生產(chǎn)的板對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響也不盡相同，建議最好使用同一廠家同一批次生產(chǎn)的板，有條件的最好使用進(jìn)口板。第二，包被抗原時(shí)注意把抗原液緩慢加到孔底，盡量避免抗原液沾到側(cè)壁上；抗原包被時(shí)間長(zhǎng)度不能有太大變動(dòng)，在本課題中，包被時(shí)長(zhǎng)每次為16 h。第三，洗滌時(shí)，注意加洗滌液的方式，最好垂直加液，加液的速度不宜過(guò)快；倒液時(shí)，應(yīng)盡量保證板面水平，且快速倒液。這樣可以減少試劑污染，縮小實(shí)驗(yàn)結(jié)果的非系統(tǒng)誤差。第四，在試驗(yàn)過(guò)程中，一抗和酶標(biāo)二抗的效價(jià)在常溫很容易降低，從而影響OD450nm值，為了使試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確，應(yīng)避免不必要的波動(dòng)，一抗和酶標(biāo)二抗均要求現(xiàn)用現(xiàn)配。第五，一些在4℃存放的緩沖液，在用前30 min要取出使溫度平衡到室溫。最后,在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中所用的洗滌劑和緩沖液在配制時(shí)都要按照要求準(zhǔn)確調(diào)節(jié)，這些微小的因素有時(shí)也能對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果產(chǎn)生不必要的誤差。總之，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中實(shí)驗(yàn)操作、試劑、儀器等應(yīng)保持前后一致，減少一切可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素，才能得到好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

本實(shí)驗(yàn)建立的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)TI的方法可以替代酶化學(xué)方法來(lái)檢測(cè)TI，從而解決了酶化學(xué)方法檢測(cè)某些發(fā)酵豆粕過(guò)程中因出現(xiàn)白色絮狀物而不能檢測(cè)這一問(wèn)題。比較來(lái)看：首先ELISA是直接以含量（mg/g）為單位來(lái)評(píng)價(jià)檢測(cè)結(jié)果，形象直觀；酶化學(xué)方法則是以被抑制的胰蛋白酶的酶活來(lái)間接反應(yīng)TI的含量，比較抽象。其次，相對(duì)于酶化學(xué)方法，靈敏度高、影響因素多、步驟相對(duì)繁瑣是ELISA的缺點(diǎn)。實(shí)際應(yīng)用時(shí)，可根據(jù)需求和檢測(cè)條件進(jìn)行合理的選擇。

我國(guó)是一個(gè)飼料資源比較缺乏的國(guó)家，加強(qiáng)對(duì)抗?fàn)I養(yǎng)因子檢測(cè)方法的研究有利于指導(dǎo)飼料生產(chǎn)加工，提高飼料利用率，為緩解飼料缺口壓力起到積極作用。