邢春芳 葛向陽

胰蛋白酶抑制劑是豆粕中重要的抗?fàn)I養(yǎng)因子之一。主要包括兩大類：Kunitz類和Bowman-Birk類，它們在理化性質(zhì)上存在一定的差異，但是兩類胰蛋白酶抑制劑都可以和動(dòng)物體內(nèi)的胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶結(jié)合，抑制其活性，最終導(dǎo)致消化不良，阻礙動(dòng)物的生長發(fā)育。

目前胰蛋白酶抑制劑檢測方法很多：脲酶檢測法、氫氧化鉀檢測法、酶化學(xué)方法、免疫學(xué)方法等，其中脲酶檢測法和氫氧化鉀檢測法都是間接的檢測胰蛋白酶抑制劑的含量。最經(jīng)典的檢測方法是Kakade酶化學(xué)方法，此方法是用反應(yīng)中被抑制的胰蛋白酶的活性反映胰蛋白酶抑制劑的含量。該方法簡單易操作，但靈敏度低，結(jié)果變異性較大，而且在檢測發(fā)酵豆粕時(shí)，反應(yīng)過程中易形成白色絮狀物，使后續(xù)的比色過程無法進(jìn)行，檢測不能完成。為了解決這一問題，本文建立了間接競爭ELISA檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

主要儀器：96孔酶標(biāo)板（JET，加拿大制造）；酶標(biāo)儀（BIO-TEK，美國制造）；水浴鍋（富華，中國制造）。

主要試劑：大豆胰蛋白酶抑制劑標(biāo)準(zhǔn)品（sigma，美國）；抗胰蛋白酶抑制劑抗體（自己制備），HRP-羊抗兔 IgG（BOSTER，中國）；包被液：0.05 M pH 值 9.6碳酸鹽緩沖液，4℃保存；洗滌緩沖液：0.15 M pH值7.40磷酸鹽緩沖液，4℃保存；封閉液：1%BSA，現(xiàn)用現(xiàn)配；底物緩沖液：pH值5.0磷酸檸檬酸緩沖液；底物：臨用前配制，1 ml TMB（10 mg TMB/5 ml無水乙醇），15 ml底物緩沖液，64 μl 30%雙氧水；終止液：2 M硫酸。

1.2 間接ELISA基本程序

按照岳磊等（2008）介紹的方法進(jìn)行ELISA操作，測定OD450nm值，每個(gè)步驟之間均用洗滌液洗滌3次，每次 5 min，根據(jù) Amax、IC50、Amax/IC50確定 ELISA 最佳反應(yīng)條件。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

1.3.1 包被抗原和一抗、二抗工作濃度的確定

用方陣滴定法進(jìn)行測定，選擇OD450nm值在1.0左右對應(yīng)的包被抗原和一抗、二抗的濃度為ELISA反應(yīng)的理想工作濃度。

1.3.2 抗原最佳包被時(shí)間的選擇

以上面得到的抗原的最佳包被工作濃度，按37℃1、2、3、4、5 h和4℃過夜進(jìn)行包被，以最佳抗血清稀釋度進(jìn)行ELISA測定，測OD450nm選擇最佳包被時(shí)間。

1.3.3 封閉液濃度和封閉時(shí)間的選擇

以濃度為0.5%、1%、1.5%、2%的BSA進(jìn)行封閉，選擇最佳封閉液濃度。然后以最佳封閉液濃度在37℃分別封閉 1、2、3和 4 h，測OD450nm選擇最佳封閉時(shí)間。

1.3.4 抗原和抗體體積比及競爭時(shí)間的選擇

以抗原和抗體體積比 70：30、60：40、50：50、40：60、30：70進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，測OD450nm選擇最佳體積比。以抗原和抗體最佳體積比，37℃按45、60、75、90 min進(jìn)行競爭反應(yīng)，測OD450nm選擇最佳競爭時(shí)間。

1.3.5 酶標(biāo)二抗作用時(shí)間的選擇

以酶標(biāo)二抗最佳稀釋度按 45、60、75、90 min進(jìn)行反應(yīng)，測OD450nm選擇最佳作用時(shí)間。

1.3.6 顯色液中TMB比例的選擇

TMB與底物緩沖液的體積比按 1：10、1：15、1：20、1：25進(jìn)行顯色反應(yīng)，測OD450nm選擇最佳體積比。

1.3.7 顯色時(shí)間的選擇

加入底物后，37 ℃顯色 10、15、20、25 min，測OD450nm選擇最佳顯色時(shí)間。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

根據(jù)上述優(yōu)化的最佳條件，進(jìn)行間接競爭ELISA測定，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。以系列稀釋度（16、4、1、1/4、1/8、1/16 μg/ml）的 TI標(biāo)準(zhǔn)液建立測定梯度，測 OD450nm。抑制率I（%）=100×[(OD對照-ODTI)/(OD對照-OD空白)]，以抑制率I為縱坐標(biāo)，TI的濃度對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程。計(jì)算IC50和IC15，對其進(jìn)行相關(guān)分析。

1.5 抗體特異性檢測

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，分別考察了抗胰蛋白酶抑制劑的抗體與豆粕中其他主要的抗?fàn)I養(yǎng)因子Glycinin與β-Conglycinin的交叉反應(yīng)，以抗體稀釋度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，OD450nm為縱坐標(biāo)作圖反應(yīng)抗體的特異性。

1.6 精密度的測定

以批內(nèi)誤差和批間誤差來表示該方法的精密度。TI的每一標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度在同一塊板內(nèi)作6次重復(fù)，計(jì)算孔間變異系數(shù)表示批內(nèi)誤差；用同等質(zhì)量的不同酶標(biāo)板重復(fù)操作6次，計(jì)算批間變異系數(shù)表示批間誤差。

1.7 樣品的前處理

考察不同浸提液對樣品的提取效果，所用浸提液有0.05 M pH值8.2 Tris-HCl，0.01 M NaOH（加入豆粕樣品后調(diào)pH值9.5）；pH值7.34 PBS、蒸餾水。稱取豆粕樣品0.5 g，加入25 ml浸提液，25℃振蕩30 min，8000 r/min離心10 min，取上清適度稀釋后按優(yōu)化好的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行ELISA分析。

1.8 回收率的測定

在空白樣品（經(jīng)高溫120℃處理30 min作為空白樣）中分別添加濃度為 0.8、1.6、2.4 μg/ml的 TI，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行，用上述建立的方法進(jìn)行檢測，計(jì)算回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 ELISA方法的建立

經(jīng)過優(yōu)化后：在96孔酶標(biāo)板上用包被液包被標(biāo)準(zhǔn)抗原（0.5 μg/ml），4 ℃過夜。用 PBST 洗板，1%BSA封閉液封板，37℃2 h，棄封閉液，PBST洗板。加梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)抗原、適度稀釋的樣品液和一抗（1：800），37℃孵育75 min。洗板后加二抗，37℃孵育75 min。洗板后加底物液，37℃反應(yīng)15 min。加終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀讀數(shù)。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1，得到的線性方程為y=16.18x+57.183（R2=0.9986）。

圖1 TI標(biāo)準(zhǔn)曲線

在ELISA中，常用IC50（抗原抗體結(jié)合反應(yīng)被抑制一半時(shí)抗原的濃度）表示靈敏度，IC50愈小，靈敏度愈高。最低檢出限則由IC15來表示，即抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的抑制率為15%時(shí)所對應(yīng)的抗原濃度。本實(shí)驗(yàn)建立的ELISA方法的靈敏度IC50為0.36 μg/ml，最低檢出限 IC15為 2 ng/ml。

2.3 抗體特異性檢測

測定結(jié)果如圖2所示，Glycinin與β-Conglycinin抗原蛋白隨著抗體稀釋度的增加所對應(yīng)的OD值變化很小，而且值很小。而TI隨著抗體稀釋度的增加所對應(yīng)的OD值呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢。這說明實(shí)驗(yàn)中所用的抗TI抗體具備顯著的特異性。

2.4 精密度的測定

通過批內(nèi)、批間變異系數(shù)的計(jì)算考察了實(shí)驗(yàn)的精密度。表1顯示了線性范圍內(nèi)各個(gè)梯度濃度的批內(nèi)變異系數(shù)為3.49%～18.77%，批間變異系數(shù)為4.55%～24.96%。

圖2 抗體特異性

表1 不同TI濃度的變異系數(shù)

2.5 樣品的前處理

在間接競爭ELISA中，OD值越小TI含量越高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3，0.05 M pH值8.2 Tris-HCl浸提效果最好。

圖3 不同浸提液的浸提效果

2.6 回收率的測定

在樣品中添加濃度為 0.8、1.6、2.4 μg/ml的胰蛋白酶抑制劑，表2顯示平均回收率依次為99.2%、93.7%、104.9%，所得樣品添加的回收率都比較高，表明該實(shí)驗(yàn)建立的間接競爭ELISA方法符合實(shí)際。

表2 樣品添加的回收率

3 結(jié)論

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)由于靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)已經(jīng)在飼料檢測中獲得了廣泛的應(yīng)用，但ELISA測定中影響因素較多。首先，酶標(biāo)板的質(zhì)量對測定結(jié)果有很大的影響，不同廠家、不同批次生產(chǎn)的板對試驗(yàn)結(jié)果的影響也不盡相同，建議最好使用同一廠家同一批次生產(chǎn)的板，有條件的最好使用進(jìn)口板。第二，包被抗原時(shí)注意把抗原液緩慢加到孔底，盡量避免抗原液沾到側(cè)壁上；抗原包被時(shí)間長度不能有太大變動(dòng)，在本課題中，包被時(shí)長每次為16 h。第三，洗滌時(shí)，注意加洗滌液的方式，最好垂直加液，加液的速度不宜過快；倒液時(shí)，應(yīng)盡量保證板面水平，且快速倒液。這樣可以減少試劑污染，縮小實(shí)驗(yàn)結(jié)果的非系統(tǒng)誤差。第四，在試驗(yàn)過程中，一抗和酶標(biāo)二抗的效價(jià)在常溫很容易降低，從而影響OD450nm值，為了使試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確，應(yīng)避免不必要的波動(dòng)，一抗和酶標(biāo)二抗均要求現(xiàn)用現(xiàn)配。第五，一些在4℃存放的緩沖液，在用前30 min要取出使溫度平衡到室溫。最后,在整個(gè)試驗(yàn)過程中所用的洗滌劑和緩沖液在配制時(shí)都要按照要求準(zhǔn)確調(diào)節(jié)，這些微小的因素有時(shí)也能對整個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果產(chǎn)生不必要的誤差?？傊?，實(shí)驗(yàn)過程中實(shí)驗(yàn)操作、試劑、儀器等應(yīng)保持前后一致，減少一切可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素，才能得到好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

本實(shí)驗(yàn)建立的間接競爭ELISA檢測TI的方法可以替代酶化學(xué)方法來檢測TI，從而解決了酶化學(xué)方法檢測某些發(fā)酵豆粕過程中因出現(xiàn)白色絮狀物而不能檢測這一問題。比較來看：首先ELISA是直接以含量（mg/g）為單位來評價(jià)檢測結(jié)果，形象直觀；酶化學(xué)方法則是以被抑制的胰蛋白酶的酶活來間接反應(yīng)TI的含量，比較抽象。其次，相對于酶化學(xué)方法，靈敏度高、影響因素多、步驟相對繁瑣是ELISA的缺點(diǎn)。實(shí)際應(yīng)用時(shí)，可根據(jù)需求和檢測條件進(jìn)行合理的選擇。

我國是一個(gè)飼料資源比較缺乏的國家，加強(qiáng)對抗?fàn)I養(yǎng)因子檢測方法的研究有利于指導(dǎo)飼料生產(chǎn)加工，提高飼料利用率，為緩解飼料缺口壓力起到積極作用。