崔麗娟，申雪慶，周東興

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030）

纖維素是地球上最豐富、數(shù)量最大的可再生資源[1]，占全球植物總干重的30%～50%[2-3]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全世界每年因廢棄物焚燒造成的直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)數(shù)十億元，利用率低（10%左右）[4-7]。目前，在利用生物學(xué)方法來(lái)處理廢棄物方面，主要存在的問(wèn)題是缺少高效分解木質(zhì)纖維素類(lèi)物質(zhì)的微生物及其發(fā)酵工藝[8]，受成本的限制。近年來(lái)，生物學(xué)方法利用纖維素類(lèi)固體降解廢棄物取得了一定的突破[9]，具有很好的應(yīng)用前景。

在纖維素分解菌的篩選及性狀研究方面，國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道很多，種類(lèi)從真菌，放線菌到細(xì)菌均有所涉及[10-11]。Peter等曾列舉總結(jié)出一系列的纖維素分解菌，大部分都是厭氧菌，其中只有3種是好氧菌[12]。利用微生物發(fā)酵堆肥方法是處理城市污泥的途徑之一。通過(guò)微生物的分解作用，可以把城市污泥和作物秸稈等轉(zhuǎn)化為優(yōu)質(zhì)的有機(jī)肥。城市污泥是一種可以再利用的有機(jī)固體廢棄物，其物理特性為絮狀體結(jié)構(gòu)，脫水性差，分散困難[13-14]，不利于好氧發(fā)酵的順利進(jìn)行，需要添加碳源（如稻殼、秸稈等），同時(shí)可增加發(fā)酵物料的孔隙度。目前在如何快速降解城市污泥和農(nóng)業(yè)廢棄物發(fā)酵過(guò)程中纖維素的應(yīng)用和作用研究方面，報(bào)道較少[15-16]。

本研究旨在在城市污泥和稻殼混合物料發(fā)酵過(guò)程的升溫階段篩選出高效纖維素降解菌，為污泥堆肥的生物處理提供原始菌株。

1 材料與方法

1.1 供試材料

哈爾濱文昌污水處理廠的脫水污泥，進(jìn)行好氧發(fā)酵，在發(fā)酵的升溫階段進(jìn)行取樣。好氧發(fā)酵設(shè)備為自行研制的臥式旋轉(zhuǎn)式污泥好氧發(fā)酵裝置。

1.2 培養(yǎng)基

①纖維素剛果紅培養(yǎng)基參見(jiàn)文獻(xiàn)[17-18]；②赫奇遜培養(yǎng)液，內(nèi)放濾紙條（1 cm×6 cm）；③羧甲基纖維素培養(yǎng)基；④PDA培養(yǎng)基；⑤液體發(fā)酵培養(yǎng)基:水解酪素0.5 g，蔗糖15.0 g，酒石酸銨5.0 g，NH4NO31.0 g，KH2PO41.0 g，NaCl 0.1 g，CaCl20.1 g，蒸餾水1000mL。

1.3 菌種分離

樣品用無(wú)菌水作梯度稀釋?zhuān)覝?60 r·min-1振蕩30 min。取10-9稀釋度的菌懸液涂布于纖維素剛果紅培養(yǎng)基初篩，置于37℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，挑取生長(zhǎng)快、紅色濃郁且透明圈大的培養(yǎng)物，以濾紙為唯一碳源的赫奇遜培養(yǎng)液進(jìn)行復(fù)篩，將濾紙分解速度快的培養(yǎng)物挑選出來(lái)，在羧甲基纖維素培養(yǎng)基上反復(fù)劃線直至得到純菌株，以此作為目標(biāo)菌。另接種PDA斜面保存。

1.4 菌株的生長(zhǎng)速率測(cè)定

挑選出的菌株接種于剛果紅平板培養(yǎng)基中央，置于37℃下恒溫恒濕條件下培養(yǎng)6 d，每天測(cè)定水解圈直徑的大小，計(jì)算水解圈直徑與天數(shù)的比值，以cm·d-1表示平均生長(zhǎng)率。

1.5 菌株對(duì)纖維素降解能力測(cè)定

將生長(zhǎng)速度快及水解圈大的菌株接種于赫奇遜培養(yǎng)液中，以不接種處理作對(duì)照，37℃、120 r·min-1搖床培養(yǎng) 10 d，分別在第 3、5、7、10天時(shí)測(cè)定其濾紙失重率。方法為用濾紙過(guò)濾發(fā)酵液，將殘留物80℃烘干稱(chēng)重，用減重法計(jì)算出濾紙失重率。

1.6 菌種鑒定

1.6.1 形態(tài)觀察及鑒定

將目標(biāo)菌接種至PDA斜面，37℃倒置培養(yǎng)72 h，觀察菌落形態(tài)，正反面顏色。真菌鑒定主要依據(jù)文獻(xiàn)[19-20]，以菌落特征和形態(tài)學(xué)特征為主。形態(tài)特征以菌絲體的形狀為主。經(jīng)處理后用掃描電子顯微鏡觀察。

1.6.2 rDNA-ITS序列的PCR擴(kuò)增、序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

該方法不僅用于分類(lèi)鑒定，還可對(duì)菌種類(lèi)群作系統(tǒng)發(fā)育分析[21]。液氮研磨液體發(fā)酵后的菌絲球，提取基因組DNA[22]，采用真菌通用引物擴(kuò)增內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的保守序列，正向引物:5′TCCGTAGGTG AACCGTCGG 3′，反 向 引 物 : 5′TCCTCCGCTTA TTGATATGC 3′；PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min，94℃ 1 min、55℃ 1 min、72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃冷卻中止反應(yīng)。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR產(chǎn)物的測(cè)序由大連寶生物工程有限公司完成，所得序列通過(guò)Blast程序與GenBank中的核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析。用MEGA4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的生長(zhǎng)速率

將復(fù)篩得到的菌株接種于剛果紅纖維素瓊脂平板，測(cè)定透明圈直徑，與天數(shù)的比值表示其生長(zhǎng)速率，該比值可說(shuō)明產(chǎn)纖維素酶量的高低或酶活性的強(qiáng)弱。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1，該比值可大致說(shuō)明產(chǎn)纖維素酶量的高低或酶活性的強(qiáng)弱。通過(guò)對(duì)比值大小進(jìn)行比較，可以判斷各不同的菌株間降解纖維素能力的差異。分析結(jié)果為C、B、E生長(zhǎng)速率較快。對(duì)初篩與復(fù)篩的結(jié)果進(jìn)行綜合分析，判斷B、E菌株為目標(biāo)菌種。

2.2 菌株對(duì)纖維素的降解能力

對(duì)照為未添加菌株的赫奇遜培養(yǎng)液，在30℃搖床培養(yǎng)10 d后無(wú)任何變化。對(duì)5個(gè)菌株進(jìn)行濾紙失重試驗(yàn)得出結(jié)論:菌株B和E對(duì)底物濾紙的降解率最高，分別為53%和39%。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3 形態(tài)特征

篩選出來(lái)的5種菌株的菌落形態(tài)特征見(jiàn)表3。

表1 菌株在剛果紅纖維素瓊脂平板上的生長(zhǎng)情況Table1 Growth of the strains on cellulose-congo red medium

表2 不同培養(yǎng)時(shí)間的濾紙失重率Table2 Ratio of weight losing of filter paper in different time （%）

表3 菌株的菌落形態(tài)觀察Table3 Colony morphological characteristics of strain

電鏡圖片及PDA斜面生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖1～5。由圖1～5可見(jiàn)，各菌株的形態(tài)特征A:絲狀菌絲體，易挑取，正反面顏色不一致，形成孢子囊，產(chǎn)生子囊孢子，菌絲有橫隔，孢子繁殖；B:白色菌落，絮狀，致密、扁平、干燥、不易挑取、生長(zhǎng)迅速，正反面顏色一致，不形成孢子，以菌絲斷裂方式繁殖，菌絲表面有刺狀突起，有橫隔，菌絲直徑5μm；C:生長(zhǎng)緩慢，初期白色菌落，后期形成有顏色的孢子，孢子直徑20μm，此為放線菌菌落特征；D:菌絲疏松，綠色，正反面顏色一致，孢子紡綞形，表面不光滑；E:菌絲體橙黃色，絲狀，生長(zhǎng)迅速，無(wú)分枝，孢子表面有皺紋，近球形。孢子直徑40μm，菌絲直徑70μm，有橫隔，極易挑取。

圖 1 A菌株的掃描電鏡圖(×8500，×2000)Fig.1 A by scanning electron-microscope

圖 2 B菌株的掃描電鏡圖(×8500，×2000)Fig.2 B by scanning electron-microscope

圖 3 C菌株的掃描電鏡圖(×8500，×2000)Fig.3 C by scanning electron-microscope

圖 4 D菌株的掃描電鏡圖(×8500，×2000)Fig.4 D by scanning electron-microscope

圖 5 E 菌株的掃描電鏡圖（×1000，×2000）Fig.5 E by scanning electron-microscope

2.4 菌株B和E的形態(tài)學(xué)鑒定

對(duì)篩選出的5個(gè)菌株，針對(duì)降解纖維素效果較好的菌株B和菌株E進(jìn)行了形態(tài)學(xué)鑒定。根據(jù)菌落形態(tài)及菌體特征判斷，菌株B和E為兩株真菌。對(duì)兩株真菌進(jìn)行rDNA-ITS序列解析（測(cè)序結(jié)果略），分別獲得GenBank登錄號(hào)FJ824032和FJ824033。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)重建結(jié)果及鑒定結(jié)論

將所測(cè)得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行相似性搜索（BLAST），選取其中已經(jīng)發(fā)表的，相似性較高的序列，與B和E的菌株序列以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，所用程序?yàn)镸EGA4，分析進(jìn)行1000次重復(fù)。

采用通用引物IST1和ITS4，對(duì)菌株的基因DNA擴(kuò)增獲得了片段大小為505bp的ITS片段，對(duì)上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，該菌株的保守序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)與尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）的高度相似，相似性達(dá)到100%。說(shuō)明兩者有特別近的親緣關(guān)系。菌株B獲得GenBank登錄號(hào)為FJ824032（見(jiàn)圖6）。

采用通用引物IST1和ITS4，對(duì)菌株的基因DNA擴(kuò)增獲得了片段大小為549bp的ITS片段，對(duì)上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，該菌株的保守序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行同源性比較（BLAST），發(fā)現(xiàn)該菌株的保守序列與脈孢菌（Neurospora sp.）高度相似，達(dá)到99%以上，認(rèn)為兩者有特別近的親緣關(guān)系。菌株E獲得GenBank登錄號(hào)為FJ824033（見(jiàn)圖 7）。

圖6 菌株B基于rDNA-ITS區(qū)序列重建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.6 Phylogeng tree of B based on rDNA-ITS sequence

圖7 菌株E基于rDNA-ITS區(qū)序列重建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.7 Phylogeng tree of E based on rDNA-ITS sequence

3 討論與結(jié)論

纖維素是地球上非常豐富的可再生性資源，如農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中產(chǎn)生的秸稈，以及城市污泥當(dāng)中存在的，若將這些物質(zhì)充分利用好，則每年能夠在很大程度上降低化學(xué)肥料的施用量，實(shí)現(xiàn)節(jié)能減排。但目前主要存在的問(wèn)題是缺少高效分解木質(zhì)纖維素類(lèi)物質(zhì)的微生物。本研究在好氧發(fā)酵過(guò)程中篩選出5株纖維素分解菌，對(duì)其中兩株降解能力強(qiáng)的菌株通過(guò)形態(tài)特征觀察、rDNA-ITS序列分析結(jié)果表明兩菌株分別為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）和脈孢菌（Neurospora sp.），在赫奇遜培養(yǎng)液中培養(yǎng)10 d后濾紙失重率分別達(dá)到53%和39%。本試驗(yàn)利用城市污泥和稻殼做為添加劑和調(diào)理劑，對(duì)纖維素分解菌進(jìn)行篩選，促進(jìn)城市和農(nóng)村廢棄物的分解和利用，在理論和應(yīng)用當(dāng)中具有很重要的實(shí)踐意義。

目前，國(guó)內(nèi)外應(yīng)用較多的是EM菌，該制劑是由80多種微生物復(fù)合而成的，應(yīng)用領(lǐng)域廣，效果較好，利用了多菌株的協(xié)同作用。本研究只篩選出了兩株效果較好的微生物菌株，其實(shí)際應(yīng)用效果需要在今后的進(jìn)一步試驗(yàn)中驗(yàn)證。本試驗(yàn)過(guò)程中使用的自制的臥式旋轉(zhuǎn)式污泥好氧發(fā)酵裝置，通過(guò)試驗(yàn)表明，該設(shè)備在物料翻轉(zhuǎn)周期和通風(fēng)控制上還存在一定問(wèn)題，需進(jìn)一步改進(jìn)，配合篩選出的好氧發(fā)酵微生物實(shí)現(xiàn)更好的廢棄物處理效果。

rDNA-ITS鑒定是一種很精確的鑒定手段，使我們能夠準(zhǔn)確認(rèn)識(shí)篩選出來(lái)的微生物種類(lèi)，為今后的實(shí)際生產(chǎn)和產(chǎn)業(yè)化目標(biāo)奠定基礎(chǔ)。下一步研究工作將針對(duì)高效分解微生物的進(jìn)一步篩選和復(fù)配，以及實(shí)際應(yīng)用效果研究方面展開(kāi)。

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