(江蘇省昆山市第一人民醫(yī)院,江蘇昆山,215300)

降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)作為神經(jīng)遞質(zhì)廣泛存在于中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)。研究表明CGRP與神經(jīng)損傷后的再生可能有密切的關(guān)系[1]。端側(cè)吻合修復(fù)臂叢神經(jīng)損傷,軸突的再生、供體神經(jīng)元重新與靶器官建立聯(lián)系,其機(jī)制十分復(fù)雜,本實驗通過測定運動終板中的CGRP及供體神經(jīng)元胞體中CGRPmRNA的變化,從一個側(cè)面觀察臂叢端側(cè)吻合后的神經(jīng)再生過程,探討端側(cè)吻合修復(fù)臂叢神經(jīng)損傷的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

雌性 Wister大鼠(由揚州大學(xué)動物中心提供)60只,體重為180～200 g,隨機(jī)分3組(A 、B、C),每組20只,右側(cè)為神經(jīng)外膜開窗吻合組。左側(cè)不作吻合,為對照組。

1.2 模型的建立[2]

1%硫噴妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉,脫毛劑脫毛,磺伏消毒,鋪巾,取鎖骨下斜向外至胸大肌止點作皮膚切口,長約4.1 cm,掀開皮膚,顯露胸大肌,于止點內(nèi)側(cè)0.15 cm處切斷胸大肌、胸小肌,手術(shù)顯微鏡下解剖分離臂叢神經(jīng)后束并切斷。而后于右側(cè)內(nèi)側(cè)束遠(yuǎn)端0.15 cm處外側(cè)外膜開窗0.12 cm×0.12 cm,將橈神經(jīng)于后束分叉遠(yuǎn)端0.15 cm處切斷,遠(yuǎn)斷端移至內(nèi)側(cè)束外膜開窗處,用11/0無損傷縫合線行兩神經(jīng)外膜端側(cè)吻合4～6針。每只大鼠左側(cè)后束切斷后,不作吻合,為對照組。大鼠常規(guī)單籠飼養(yǎng),A、B、C 3組分別于術(shù)后4、8、12周麻醉,迅速在手術(shù)顯微鏡下,解剖取出C4～T2脊髓節(jié)段,并將脊髓節(jié)段于正中矢狀面分開,及肱三頭肌分別放入液氮中,-70℃凍存,備用。

1.3 肱三頭肌CGRP的檢測

取出肱三頭肌標(biāo)本,研缽中粉碎組織塊,加入RIPA緩沖液(每克組織3m L RIPA),PMSF(每克組織30μL,10 m g/m L PMSF),進(jìn)一步勻漿(15 000轉(zhuǎn)/分×1分鐘)維持4℃。加入PMSF(同上),冰上孵育30 min。移入離心管4℃,約15 000轉(zhuǎn)離心15 min,收集上清-20℃保存。Bradford比色法測定蛋白質(zhì)濃度。每個樣品與等體積的2倍的上樣buffer混勻,煮沸5min,12%SDS-PAGE電泳分離后,將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉1 h后,加入一抗(兔抗人CGRP抗體),4℃過夜,加入HRP標(biāo)記的二抗,孵育1 h,ECL顯色,曝光。

1.4 western blotting法檢測脊髓CGRP表達(dá)同上。

表1 大鼠兩側(cè)各時間組肱三頭肌CGRP的表達(dá)(±s)

表1 大鼠兩側(cè)各時間組肱三頭肌CGRP的表達(dá)(±s)

注:與其他時間組比較,＊＊P<0.01,＊P<0.05;與對照組比較,■■P<0.01,■P<0.05

CGRP/β-actin組別 樣本數(shù)A B C吻合組 20 0.15±0.02＊＊■■ 0.35±0.04＊＊■■ 0.85±0.05＊＊■■對照組 20 0 0 0

1.5 RT-PCR檢測脊髓CGRPmRNA表達(dá)水平

取脊髓標(biāo)本,加入Trizol試劑1m L,在冰浴中迅速勻漿30～60 s,至肉眼無可見組織塊為止,依次分別加入氯仿、異丙醇,提取總RNA。紫外分光光度計測定RNA濃度。取2μg RNA隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后行PCR反應(yīng)。β-actin作為參照,引物的正向序列為5′-ATCTGGCACCACACCTTC-3′, 反向序列為 5′-AGCCAGGTCC AGACGCA-3′,擴(kuò)增片段約 288 bp。CGRP正向引物序列為5′-TCCTGCA-ACACCGCCACCTG-3′, 反向序列為 5′-GGTGGGCACAAAGTTGTCC T-3′,擴(kuò)增片段約111 bp。按照試劑盒說明完成操作,運用Bio-Red凝膠成像系統(tǒng)攝像。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)用(s)表示,組間比較采用 t檢驗,組內(nèi)比較采用單因素方差分析,運用SPSS 10.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié) 果

2.1 大體觀察

術(shù)后所有動物都存活,術(shù)后1個月內(nèi)大鼠前足趾甲色澤稍暗淡,足部皮毛稀疏,個別動物出現(xiàn)前足潰瘍和自噬。3個月后,大鼠右側(cè)趾甲紅潤,足毛恢復(fù)正常,左側(cè)無明顯改善。右側(cè)臂叢神經(jīng)圓潤、豐滿、光澤度好,與之相連的肌群飽滿、有彈性。而左側(cè)臂叢神經(jīng)菲薄、纖細(xì),與之相連的肌群明顯萎縮。

2.2 肱三頭肌及脊髓CGRP蛋白的表達(dá)

Western blotting方法檢測臂叢損傷后吻合組與對照組肱三頭肌以及脊髓CGRP蛋白的表達(dá)量。結(jié)果表明,吻合組術(shù)后4周運動終板中CGRP的表達(dá)在較低水平,隨著時間的增加,實驗組CGRP的表達(dá)水平顯著回升(P<0.01)。而對照組CGRP則不表達(dá)(表1,圖1)。脊髓中CGRP的表達(dá)水平,實驗組隨時間變化顯著回升(P<0.01),對照組則維持較低水平,無顯著變化(表2,圖2)。

表2 大鼠兩側(cè)各時間組脊髓CGRP的表達(dá)(±s)

表2 大鼠兩側(cè)各時間組脊髓CGRP的表達(dá)(±s)

注:與其他時間組比較,＊＊P<0.01;與對照組比較,■■P<0.01

CGRP/β-actin組別 樣本數(shù)A B C吻合組 20 0.31±0.06＊＊ 0.67±0.08＊＊■■ 0.92±0.10＊＊■■對照組 20 0.35±0.04 0.31±0.05 0.33±0.04

圖1 大鼠兩側(cè)各時間組肱三頭肌CGRP的表達(dá)A:4周組;B:8周組;C:12周組

圖2 大鼠兩側(cè)各時間組脊髓CGRP的表達(dá)A:4周組;B:8周組;C:12周組

2.3 脊髓CGRPm RNA的表達(dá)

上調(diào)(P<0.05),不同時間組之間比較差異性顯著(P<0.01)。對照組CGRPmRNA低表達(dá),且各時間組之間呈下降趨勢,但差異性不顯著。

表3 大鼠兩側(cè)各時間組脊髓CGRP mRNA的表達(dá)( x±s)

圖3 大鼠兩側(cè)各時間組脊髓CGRP mRNA的表達(dá)M:marker;A1:對照組4周組;B1:對照組8周組;C1:對照組12周組;A 2:吻合組4周組;B2:吻合組8周組;C2:吻合組12周組

3 討 論

CGRP是一種神經(jīng)肽類物質(zhì),在脊髓神經(jīng)元及運動終板中均有分布,神經(jīng)損傷后可引起中樞及外周部位CGRP的表達(dá)變化。Wang S等研究提示:CGRP可能通過上調(diào)Bcl-2的表達(dá)對神經(jīng)元起保護(hù)作用[3]。在大鼠坐骨神經(jīng)壓榨損傷研究中發(fā)現(xiàn):神經(jīng)損傷 1 d后,在損傷部位近端CGRP陽性產(chǎn)物大量堆積,21 d再生軸突通過壓榨部位后CGRP的堆積基本消失[4],Seybold等推測可能是壓榨損傷后的軸突軸漿流立即中斷引起了早期CGRP在神經(jīng)內(nèi)的大量堆積,并且通過某一機(jī)制將損傷信息傳遞給背根節(jié)和脊髓,引起CGRP出現(xiàn)次序高峰表達(dá)以激活其信號通路中的下游p-CREB和c-fos[5-6],促進(jìn)神經(jīng)元再生、存活。

CGRP與運動終板亦有著密切的關(guān)系,研究發(fā)現(xiàn):CGRP與乙酰膽堿(AchE)共存于運動終板,可以刺激乙酰膽堿受體的合成和積聚[7-8]。周圍神經(jīng)損傷后CGRP在運動終板中的脫失提示CGRP與運動終板的退變相關(guān),張慶民等[9]實驗證明,脊髓橫斷1周后CGRP在運動終板中的數(shù)量、分布即明顯減少,著色變淺,而AChE在運動終板中的變化發(fā)生在損傷后4周時,即CGRP出現(xiàn)變化的時間早于AchE,但兩者均始終未完全消失,且整個變化趨勢是一致的,推測CGRP的缺乏很可能是運動終板退變的一個重要因素。王樹森等[10]研究發(fā)現(xiàn):坐骨神經(jīng)損傷 1周后CGRP即在脊髓前角運動神經(jīng)元中升至最高,并持續(xù)4周,8周后恢復(fù)正常,而在神經(jīng)末梢和運動終板中即完全消失,提示CGRP在神經(jīng)再生和運動終板再次形成過程中很可能是一種“終板分化信號”,它誘導(dǎo)肌肉細(xì)胞上的乙酰膽堿受體的合成,同時阻止軸突在肌肉內(nèi)的繼續(xù)生長。

本實驗通過建立端側(cè)吻合技術(shù)修復(fù)臂叢神經(jīng)損傷的大鼠實驗?zāi)Ｐ?研究了端側(cè)吻合后脊髓供體神經(jīng)元,以及運動終板中CGRP的變化情況。結(jié)果顯示神經(jīng)端側(cè)吻合后隨時間的延長,脊髓及運動終板中CGRP的表達(dá)均顯著升高,而不做吻合的對照組中,脊髓CGRP表達(dá)維持較低水平,且呈下降趨勢,但差異性不顯著,運動終板中無CGRP的表達(dá)。本課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)臂叢損傷端側(cè)吻合后對失神經(jīng)肌肉及運動終板具有保護(hù)作用,能有效防止失神經(jīng)肌萎縮。結(jié)合本實驗研究,提示CGRP在端側(cè)吻合修復(fù)臂叢神經(jīng)損傷,軸突的再生、供體神經(jīng)元重新與靶器官建立聯(lián)系的過程中起著重要作用。

綜上所述,端側(cè)吻合作為處理臂叢神經(jīng)損傷的一種可行性方法。其作用機(jī)制可能與提高供體神經(jīng)元CGRP的表達(dá),進(jìn)而恢復(fù)運動終板的功能有關(guān)。

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