沈 波,劉寧波,彭 韜,冷 靜

(1.江蘇省南京明基醫(yī)院病理科,江蘇南京,210019;2.南京醫(yī)科大學(xué) 病理系,江蘇南京,210029)

近年來人們發(fā)現(xiàn)長期服用阿司匹林可以降低消化道腫瘤的發(fā)病率。研究顯示阿司匹林作用的靶分子-環(huán)氧合酶-2(COX-2)在一些腫瘤中表達(dá)升高,并認(rèn)為COX-2可促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展。為此作者選擇江蘇省人民醫(yī)院10例手術(shù)切除的原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)組織,觀察了肝細(xì)胞癌組織中COX-2的表達(dá)狀況,并探討肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展機(jī)理中COX-2表達(dá)和p16蛋白的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

選擇江蘇省人民醫(yī)院手術(shù)切除原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)石蠟包埋標(biāo)本10例,組織類型均為高中分化型。

1.2 檢測試劑

COX-2單克隆抗體購自Cayman公司,p16單克隆抗體購自福州邁新公司。免疫組化二步法試劑盒購自美國DAKO公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

采用Envision二步法免疫組織化學(xué)染色。將甲醛固定、石蠟包埋的上述腫瘤組織4 μ m連續(xù)切片,常規(guī)脫蠟、水化,PBS(PH7.4,下同)洗5 min。1%H2O2室溫封閉10 min,阻斷內(nèi)源性過氧化酶,PBS洗2次,每次5 min。微波處理抗原修復(fù)20 min,PBS洗2次,每次5 min。每張切片滴加50 μ L一抗,4 ℃過夜,PBS洗2次,每次5 min。每張切片滴加50 μ L二抗,37℃孵育45 min,PBS洗2次,每次5 min。PBS洗 2次后加顯色液,顯微鏡下隨時(shí)觀察顯色反應(yīng),至陽性顯色較強(qiáng)而背景不顯色,蘇木素襯染、透明,中性樹膠封片。用已知陽性切片作對照。用Leica RX250型圖像分析系統(tǒng)采集圖像,每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)抽取5個(gè)高倍視野(×400),Qwin軟件識別陽性表達(dá)面積百分比,取其均值。

1.4 結(jié)果判斷

COX-2陽性表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)為:被測細(xì)胞胞質(zhì)出現(xiàn)明顯棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞,陽性細(xì)胞≥10%者判為陽性結(jié)果,<10%者判為陰性結(jié)果[1]。P16陽性表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)為:被測細(xì)胞胞質(zhì)出現(xiàn)明顯棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞,陽性細(xì)胞≥10%者判為陽性結(jié)果,<10%者判為陰性結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 COX-2、P16的表達(dá)

COX-2在肝細(xì)胞癌中過表達(dá),而P16在肝細(xì)胞癌中低表達(dá)。肝癌組織和癌旁組織中COX-2陽性表達(dá)率、COX-2陽性面積百分比、P16陽性表達(dá)率、P16陽性面積百分比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),具體數(shù)值見表1。

表1 肝癌組織及癌旁組織中的C OX-2、P16陽性表達(dá)率(%)及陽性面積百分比(%)

2.2 COX-2與P16的相關(guān)性

COX-2陽性組中P16陽性表達(dá)率10%(1/10),COX-2陰性組中P16陽性表達(dá)率為70%(7/10),2者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。肝癌組織中COX-2與P16蛋白陽性面積百分比之間有負(fù)相關(guān)性(P<0.05)。

3 討 論

環(huán)氧合酶有3種基因型:結(jié)構(gòu)性COX-1,誘導(dǎo)性COX-2和新發(fā)現(xiàn)的COX-3。COX-2可被多種因素誘導(dǎo),在炎癥細(xì)胞中表達(dá)。近年來的研究表明,COX-2不僅是炎癥反應(yīng)的重要環(huán)節(jié),而且在很多腫瘤組織中表達(dá)上調(diào),由COX-2催化合成的PGE2是誘發(fā)腫瘤細(xì)胞增殖的重要原因。Leng J等[2]研究發(fā)現(xiàn),使用外源性PGE2處理或?qū)⒑亟MCOX-2基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染多種肝細(xì)胞癌細(xì)胞株能明顯促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖;將反義COX-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染上述腫瘤則可抑制細(xì)胞增殖。

P16屬于細(xì)胞周期蛋白激酶抑制蛋白(CDKI),參與細(xì)胞G1期進(jìn)入S期的負(fù)調(diào)控,可防止細(xì)胞過度增殖和惡性變,其作用機(jī)制是抑制CDK的活性,阻斷Rb的磷酸化,使細(xì)胞停滯于G1期,進(jìn)而促使細(xì)胞發(fā)生分化,或者促使細(xì)胞發(fā)生凋亡,或者使細(xì)胞進(jìn)入靜止期。Matsuda Y等[3]、Qin Y等[4]研究表明P16基因在原發(fā)性肝細(xì)胞癌中表達(dá)缺失。程劍等[5]、周梅芳等[6]將含重組P16基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SMMC-7721肝細(xì)胞癌株能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

COX-2導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生可能是通過促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。劉寧波等[7]使用COX-2抑制劑celecoxib能抑制肝癌細(xì)胞增生,促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。目前,COX-2與P16的相關(guān)性研究甚少,且并不一致。翟俊山等[8]發(fā)現(xiàn)在胃癌組織中COX-2和P16存在負(fù)相關(guān)性。Ruibal A等[9]發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌中COX-2與P16存在正相關(guān)性。Xigui Yang等[10]在非霍奇金淋巴瘤中發(fā)現(xiàn)COX-2和P16無相關(guān)性。在肝癌組織中尚未見COX-2與P16相關(guān)性文獻(xiàn)。作者的研究發(fā)現(xiàn)10例肝癌組織中COX-2過表達(dá),P16低表達(dá),COX-2和P16表達(dá)水平有負(fù)相關(guān)性。提示COX-2有可能通過減少P16的合成量,從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和惡性變。

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