劉 芳 孫 黎 楊翠軍 李 華 劉開揚(yáng)

(河北北方學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心,河北 張家口 075000)

CYP1A1是細(xì)胞色素 P(CYP)450家族的一名成員,是體內(nèi)重要的Ⅰ相解毒酶之一,參與多種內(nèi)外源性化學(xué)物質(zhì)體內(nèi)代謝過程〔1〕。 CYP1A1由 CYP1A1基因編碼,CYP1A1表達(dá)受基因控制和環(huán)境因素誘導(dǎo),并存在種族和個(gè)體差異。主要分布于肺、腎、胃腸道、皮膚、胎盤等組織中,參與內(nèi)源性和外源性化合物在體內(nèi)代謝過程,主要通過氧化、還原、水解等作用,改變化合物所具有的功能基團(tuán)?；蚴蛊浞纸?。CYP1A 1主要參與多環(huán)芳烴類化合物(PAH)的代謝,把其代謝為酚類物質(zhì)活性很強(qiáng)的環(huán)氧化物,這些環(huán)氧化物在致癌、致突變中都有重要作用〔2,3〕。目前為止,已發(fā)現(xiàn)CYP1A1基因 MSPI和 Ile/Val多態(tài)在不同的種族、民族和地區(qū)的分布有很大差異。本試驗(yàn)采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)的技術(shù),探討張家口地區(qū)健康人群 CYP1A 1基因的 Msp I和 Ile/Val多態(tài)性分布。

1 材料與方法

1.1 研究對象 隨機(jī)選擇 360例無血緣關(guān)系的健康張家口地區(qū)人員,均在原籍穩(wěn)定居住 2代以上,年齡 18～55歲。經(jīng)張家口河北北方學(xué)院第一附屬醫(yī)院門診查體健康,無遺傳疾病的健康人群。其中男性 186例,女性 174例。

1.2 標(biāo)本收集 從上述人群中每人抽取外周靜脈全血 3 ml,EDTA抗凝,-80℃保存待測。

1.3 基因組DNA的制備 DNA提取試劑盒提取DNA。

1.4 PCR反應(yīng)

1.4.1 MspI基因型測定 采用等位基因特異性擴(kuò)增方法PCR-RFLP技術(shù),MspI基因型測定所需引物,其序列為上游 5′-CAGTGAAGAGGTGTAGCCGCT-3′,下游 5′-TAGGAGTCTTGTCTCATGCCT-3′。PCR的反應(yīng)條件:反應(yīng)總體積 50μl,含有200μmol/L dNTP,上、下游引物各 0.4μmol/L,基因組 DNA 0.4μg,1 U TaqDNA聚合酶。在 PCR儀上擴(kuò)增,擴(kuò)增參數(shù):97℃預(yù)變性 7 min,然后 95℃,50 s,66℃復(fù)性 50 s,72℃延伸1 min,30個(gè)循環(huán)后 72℃延伸 10min。其 PCR產(chǎn)物為 340bp的DNA片段。取 10μl PCR產(chǎn)物,加 10 U Msp I限制性內(nèi)切酶,37℃水浴 4 h,酶切產(chǎn)物經(jīng) 1.8%瓊脂糖凝膠(含 0.5μg/ml溴化乙錠)電泳 40 min,電壓 150 V,在紫外透射儀上觀察結(jié)果。

1.4.2 Ile/Val多態(tài)性測定 采用等位基因特異性擴(kuò)增方法PCR-RFLP技術(shù),分析 Ile/Val多態(tài)性,引物序列:上游 5-CTGTCTCCCTCTGGTTACAGGAAGC-3′,下游 5′-TTCCACCCGTTGCAGCAGGATAGCC-3′。反應(yīng)體系同上,擴(kuò)增參數(shù):95℃預(yù)變性5 min,然后 95℃,30 s,63.5℃復(fù)性 30s,72℃延伸 30 s,30個(gè)循環(huán)后 72℃延伸 7 min。其 PCR產(chǎn)物為 204bp的 DNA片段。取10μl PCR產(chǎn)物,加 10U BsrD I限制性內(nèi)切酶,25℃水浴 24 h,酶切產(chǎn)物觀察同上。

1.5 CYP1A 1多態(tài)性

1.5.1 MspI基因型 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)酶切后分為 3種基因型:沒有 MspI切割位點(diǎn)的等位基因m1的純合子基因型m1m1(野生型),可見 340 bp一個(gè)片段;有 MspI切割位點(diǎn)的等位基因m2的純合子基因型 m2m2(突變型),可見 200及 140 bp兩個(gè)片段;m1和 m2的雜合子基因型 m1m2(雜合型),可見 340,200,140bp三個(gè)片段。

1.5.2 Ile/Val多態(tài)性 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)酶切后分為 3種基因型:沒有切割位點(diǎn)為純合子基因型Ile/Ile(野生型),可見 204bp一個(gè)片段;有BsrD I切割位點(diǎn)的等位基因Val/Val的純合子基因型 (突變型),可見 65及 139 bp兩個(gè)片段;Ile/Val(雜合型),可見 204,139,65bp三個(gè)片段。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS軟件分析,用 χ2檢驗(yàn)法比較基因多態(tài)性等位基因頻率的差異,檢驗(yàn)群體基因型頻率分布是否符合 Hardy-Weinberg平衡定律。

2 結(jié) 果

2.1 CYP1A 1基因Msp I多態(tài)分布 張家口地區(qū)健康人群該基因多態(tài)位點(diǎn) m1及m2等位基因的頻率分別為 60.9%,39.1%。m1m1,m1m2,m2m2基因型分布頻率分別為 35.8%,50.2%,14.0%。經(jīng) χ2檢驗(yàn)基因型分布符合 Hardy-Weinberg平衡定律(P＞0.05)。

2.2 CYP1A 1基因Ile/Val多態(tài)性 張家口地區(qū)健康人群該多態(tài)位點(diǎn) Ile及 Val等位基因的頻率分別為 68.5%,31.5%。Ile/Ile,Ile/Val,Val/Val基因型分布頻率分別為 44.4%,48.1%,7.5%。經(jīng) χ2檢驗(yàn)基因型分布符合 Hardy-Weinberg平衡定律(P＞0.05)。

3 討 論

CYP1A1是細(xì)胞色素P450家族的一名成員,是外源性和內(nèi)源性化合物在體內(nèi)代謝的重要Ⅰ相酶之一〔4,5〕。其參與 PAH如苯并芘的代謝,將其氧化為酚類產(chǎn)物和環(huán)氧化物。CYP1A1基因位于人類第 15對染色體,有 7個(gè)外顯子和 6個(gè)內(nèi)含子。目前研究發(fā)現(xiàn),亞洲人群 CYP1A1基因在其 DNA結(jié)構(gòu)的 3′端非翻譯區(qū) 6235位點(diǎn) T→C突變形成 MspI酶切位點(diǎn),即 CYP1A 1基因 MspI多態(tài)性,突變基因可影響 CYP1A1的誘導(dǎo)性〔6〕,研究發(fā)現(xiàn) CYP1A 1的T6235C位點(diǎn)突變不但增加了酶的活性,而且提高了酶的誘導(dǎo)性。同時(shí),CYP1A1基因MspI多態(tài)分布具有明顯的地區(qū)和種族差異。Ile/Val多態(tài)性是由于第七外顯子4 889 kb位置上的 A-G突變,導(dǎo)致酶蛋白水平表現(xiàn)為亮氨酸變成纈氨酸,Val-Ile多態(tài)性可被限制性內(nèi)切酶BsrDⅠ識(shí)別,研究發(fā)現(xiàn)攜帶 Ile/Val,Val/Val的病人比Ile/Ile病人在某些腫瘤疾病中表現(xiàn)出更大的危險(xiǎn)性。本研究發(fā)現(xiàn)張家口地區(qū)正常人群CYP1A 1基因呈多態(tài)性分布,為進(jìn)一步研究張家口地區(qū)CYP1A 1基因多態(tài)性與腫瘤等疾病的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

1 Miyoshi Y,Takahashi Y,Egawa C,et al.Breast cancer risk associated with CYP1A1 genetic polymorphisms in Japanese women〔J〕.Breast J,2002;8(4):20.

2 Hayashi SI,Watanabe J,Nakachi K,et al.Genetic linkage of lung cancerassociated MspⅠpolymorphisms with amino acid replacement in the hemebinding region of the human cytochrome P450 1A1 gene〔J〕.J Biochem,1991;110(3):407.

3 Belogubova EV,Ulibina YM,Suvorova IK,et al.Combined CYP1A1/GSTM1at-risk genotypesare overrepresented in squamous cell lung carcinoma patients but underrepresented in elderly tumor-free subjects〔J〕.J Cancer Res Clin Oncol,2006;132(5):327-31.

4 李佳圓,龍啟明.有機(jī)氯農(nóng)藥、CYP1A1易感基因型與乳腺癌的相互作用研究〔J〕.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2008;35(1):34-8.

5 Agundez JA.Cytochrome P450 gene polymorphism and cancer〔J〕.Curt Drug Metab,2004;5(3):211-24.

6 尹 琴,常福厚,王敏杰,等.蒙古族與漢族學(xué)生 CYP1A1基因多態(tài)性比較〔J〕.中國公共衛(wèi)生,2009;25(9):1053-4.