梁艷麗，趙慶云，謝世清

（云南農業(yè)大學農學與生物技術學院，云南昆明，650201）

盾葉薯蕷 （Dioscorea zingiberensisC.H.Wright）是薯蕷科薯蕷屬的一種多年生纏繞性草質藤本植物[1]，是重要的藥源植物，其主要有效成分薯蕷皂甙元是合成甾體激素類藥物長效口服避孕藥皮質激素及抗休克等藥物的主要原料，國內外需求量很大。由于過度采挖，其野生資源已瀕臨枯竭，進行人工栽培是發(fā)展盾葉薯蕷產業(yè)的必由之路[4]。盾葉薯蕷人工栽培主要采用以根狀莖作種的無性繁殖手段。這種繁殖用種量大，繁殖系數很低，繁殖的速度和數量難以滿足實際生產需求。加之根狀莖本身即是盾葉薯蕷的經濟器官，采用根狀莖繁殖造成盾葉薯蕷繁殖成本居高不下[5]。為加速盾葉薯蕷在農業(yè)生產中的推廣應用，并節(jié)約農業(yè)生產成本，采用植物組織培養(yǎng)技術對其進行種源快繁是一條有效的途徑[6]。本文通過對外植體的選擇、誘導培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基及生根培養(yǎng)基的研究，旨在為盾葉薯蕷快繁育苗體系的建立提供一定的技術及理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試材為由云南農業(yè)大學魔芋研究所提供的盾葉薯蕷優(yōu)良品系盾薯38。取溫室大棚栽植的植株幼葉、帶節(jié)莖段和根狀莖作為外植體。

1.2 試驗方法

材料取回后，先用清水浸泡15～25 min，用洗衣粉水清洗，再用自來水漂洗，用蒸餾水沖洗3～5次備用。在無菌操作臺上，無菌條件下用75%酒精浸洗30 s，蒸餾水沖洗2次，再用0.1%升汞浸泡3～5 min，蒸餾水清洗4～6次，切成大小適宜的小塊，即可接種。

誘導培養(yǎng)基和增殖培養(yǎng)基均以MS為基本培養(yǎng)基，生根培養(yǎng)基以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的6-BA和NAA。培養(yǎng)基的pH值為5.8，瓊脂濃度為6.5 g/L。培養(yǎng)基于121℃滅菌20 min。培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，光照條件為每1 m240 W節(jié)能燈管2根，每天光照時間為12～14 h。

2 結果與分析

2.1 不同外植體滅菌效果的比較

從表1可以看出，在相同條件下，不同外植體的污染率存在較大差異，根狀莖的污染率最高，為60%，而莖段的污染率最低，僅為20%，幼葉的污染率介于二者之間。但由于幼葉較為柔嫩，對滅菌藥品的耐受能力較差，滅菌處理后，多數葉片都出現焦枯現象，死亡率較高，因此，滅菌效果最好的外植體為帶節(jié)莖段。且在試驗過程中發(fā)現，帶節(jié)莖段在接種30 d后，長出的腋芽和不定芽較多，誘導效果明顯好于幼葉和根狀莖，因此帶節(jié)莖段為最佳外植體。在后續(xù)的試驗中，均以帶節(jié)莖段作為外植體進行操作。

2.2 不同濃度的6-BA與不同濃度的NAA配比對盾葉薯蕷莖段芽誘導的影響

本試驗以帶節(jié)莖段作為外植體，設計了10種培養(yǎng)基對其進行芽誘導。接種5 d后，部分處理在莖切口處即開始顯現綠色，25 d后各處理先后出現不定芽，接種30 d后統(tǒng)計結果。從表2可以看出，不同的激素以及不同的濃度誘導效果有較大的差異。從1號和2號培養(yǎng)基的比較中可以看出，在6-BA均為2 mg/L時，在培養(yǎng)基中添加NAA有助于誘導成功，誘導率提高了10%。在NAA濃度為0.20 mg/L時，隨著6-BA濃度的增加，誘導率反而呈現下降趨勢，說明高濃度的6-BA并不利于外植體的分化。且在試驗過程中發(fā)現，6-BA濃度過高時，芽個體變小，芽色變白，玻璃化現象較為嚴重。在6-BA濃度均為3 mg/L的情況下，隨著NAA濃度的增加，誘導率有上升的趨勢，但當NAA濃度大于0.5 mg/L時，表現出明顯抑制生長的現象，體現了生長素低濃度促進生長，超高濃度抑制生長的特性。從10種培養(yǎng)基的比較中可知，較低濃度的6-BA和適宜濃度的NAA對莖段外植體的芽誘導有明顯的促進作用，其中，以2號培養(yǎng)基誘導效果最好，誘導率最高，達到70%，因此最佳誘導培養(yǎng)基應為MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.20 mg/L（表 2）。

表1 不同外植體滅菌效果比較

2.3 不同濃度的6-BA與不同濃度的NAA配比對盾葉薯蕷增殖的影響

外植體誘導30 d后，即可進行繼代增殖培養(yǎng)。將誘導產生的芽轉接到增殖培養(yǎng)基上5 d后，均有明顯的增粗和伸長，15 d后有叢生芽出現。轉接30 d后統(tǒng)計增殖系數。

從表3中可知，參照前序試驗而制定的6種培養(yǎng)基對盾葉薯蕷的增殖效果均較好。6-BA在1～2 mg/L，NAA在0.1～0.3 mg/L的范圍增殖系數均較高，在3.0～6.0。但不同激素濃度配比對增殖效果的影響還是有所差異的，當6-BA濃度為2 mg/L時其平均增殖系數為5.3，當6-BA濃度為1 mg/L時其平均增殖系數為3.6，說明適當增加6-BA濃度有利于盾葉薯蕷組培苗的增殖。同時，NAA濃度的變化對增殖效果也產生了明顯的影響，當6-BA濃度不變時，隨著NAA濃度的增加，出芽數呈明顯下降趨勢，說明高濃度的NAA會抑制盾葉薯蕷不定芽的產生。試驗過程中還發(fā)現，低濃度的6-BA條件下雖然增殖系數偏低，芽生長速度較快，易于成苗，但苗較為纖細；高濃度的6-BA雖然有利于提高增殖系數，但幼苗生長較慢，出苗時間長，苗更為健壯。綜合以上因素，盾葉薯蕷不定芽增殖的最佳培養(yǎng)基應為4號培養(yǎng)基，其增殖系數達到6.0。增殖效果最差的培養(yǎng)基為3號培養(yǎng)基，增殖系數最低，為3.0。因此，最佳增殖繼代培養(yǎng)基應為MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.1 mg/L。

表2 不同激素濃度配比對盾葉薯蕷芽誘導的影響

表3 不同激素濃度配比對盾葉薯蕷組培苗增殖的影響

2.4 不同濃度的NAA對盾葉薯蕷生根的影響

待增殖芽苗高于4 cm時即可進行生根培養(yǎng)。本試驗以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的NAA進行生根培養(yǎng)。轉接10 d后，部分培養(yǎng)基上即有根原基出現。發(fā)根初期，不定根附著于培養(yǎng)基的表面，隨后逐漸深入培養(yǎng)基內部，并逐漸形成須根。不同NAA濃度的培養(yǎng)基在組培苗發(fā)根的早遲、生根率等方面均存在較大差異。從表4可以得出，在這6種培養(yǎng)基中，以3號培養(yǎng)基發(fā)根最早，5號和6號培養(yǎng)基發(fā)根最遲。生根株數也以3號培養(yǎng)基最多，為26株。

隨著NAA濃度的增加，試管苗生根率有所增加，說明NAA的確有誘導生根的良好作用。但當NAA濃度高于0.5 mg/L時，生根率呈現迅速下降趨勢。這一規(guī)律說明，NAA只有在適宜濃度的條件下才有利于盾葉薯蕷組培苗的生根。綜合發(fā)根時間、生根率及根系生長情況得知，在參試的6種培養(yǎng)基中，以3號培養(yǎng)基生根效果最好，不僅生根率最高，為87%，且發(fā)根早，根系粗壯，白凈，須根最多。因此，盾葉薯蕷最適生根培養(yǎng)基為1/2 MS+NAA 0.5 mg/L。

表4 不同NAA濃度對盾葉薯蕷生根的影響

3 討論

3.1 外植體的選擇

在盾葉薯蕷的離體培養(yǎng)中，外植體的選擇非常重要。為了提高誘導率，一般選擇植株的幼嫩部分作為組織培養(yǎng)的外植體[9]。植物組織幼嫩，生命力強，有利于誘導和分化[10]。但幼嫩部分往往對消毒的耐受能力較差，導致棄材率較高，誘導效率不高，如本試驗中的幼葉。本試驗采用相對較成熟的帶節(jié)莖段作為外植體，比用幼葉的誘導效果好，誘導率較高。而根狀莖深埋于土層當中，內部可能帶有細菌和病毒，所以導致滅菌不徹底，污染率最高，不適宜作為盾葉薯蕷組培快繁的外植體。

3.2 生根的問題

本試驗最高生根率為87%，最低生根率為20%，與前人的100%的生根率相比有一定差距。生根率偏低可能與在培養(yǎng)基中沒有添加細胞分裂素類物質有關。因考慮到細胞分裂素利于芽的分化，生長素利于根的分化的特點，在培養(yǎng)基設計時，為了提高培養(yǎng)基中生長素與細胞分裂素的比值，利于生根，就僅在培養(yǎng)基中加入生長素而沒有添加細胞分裂素。但細胞分裂素的缺乏可能導致細胞分裂受抑制，從而表現為生根率不高。在后續(xù)的試驗中還需進一步考察培養(yǎng)基中添加6-BA對盾葉薯蕷生根的影響。

4 結論

由試驗結果可知，在幼葉、莖段和根狀莖的比較中，帶節(jié)莖段是最適宜的外植體。以莖段作為外植體的最佳誘導培養(yǎng)基為MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.20 mg/L。最佳增殖繼代培養(yǎng)基應為MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.1 mg/L。盾葉薯蕷最適生根培養(yǎng)基為1/2 MS+NAA 0.5 mg/L。

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