張麗 ，吳小剛 ，張力群 ，康玉凡 ，梁海榮

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，北京，100193；2.寧波五龍?zhí)妒卟耸称酚邢薰荆?/p>

伴隨著社會(huì)、經(jīng)濟(jì)，特別是科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，我國(guó)傳統(tǒng)家庭作坊式的豆芽生產(chǎn)已被日產(chǎn)60～150 t的程序化、機(jī)械化、自動(dòng)化、可調(diào)控的現(xiàn)代生產(chǎn)方式，即豆芽工廠化生產(chǎn)所取代。豆芽工廠化生產(chǎn)采用流水線式作業(yè)，即從精選原料豆-清洗、燙豆-浸泡-車(chē)間裝罐預(yù)生-孵化培育（進(jìn)入生長(zhǎng)期）-淋水-出罐-漂洗去豆皮-成品包裝-保鮮庫(kù)存放，到冷鏈進(jìn)入市場(chǎng)銷(xiāo)售；其規(guī)模大、環(huán)節(jié)多、鏈條長(zhǎng)，尤其是孵化培育過(guò)程中溫度高、濕度大、避光和相對(duì)封閉的環(huán)境條件[1]，管理工作的百密一疏，都可導(dǎo)致因種子帶菌或環(huán)境污染引起有害微生物滋生發(fā)展，導(dǎo)致豆芽星點(diǎn)狀、團(tuán)狀或窩狀爛芽，廢棄爛芽損失量約為生產(chǎn)量的10%，而影響豆芽產(chǎn)品的品質(zhì)與加工效率，以日產(chǎn)70 t計(jì)算，每年經(jīng)濟(jì)損失達(dá)350萬(wàn)元左右。因此，開(kāi)展工廠化生產(chǎn)豆芽爛芽的病原菌分離鑒定及其致病性研究具有重要的經(jīng)濟(jì)社會(huì)意義和生產(chǎn)實(shí)踐意義。

豆科植物是腐霉菌的主要寄主之一，有報(bào)道顯示腐霉菌能引起俄亥俄州地區(qū)大豆的根腐病和猝倒病[2]；國(guó)外學(xué)者Charles研究表明蕓豆和利馬豆上的根腐病是Fusarium，Rhizoctonia，Pythium三種病原菌共同作用引起的[3]。黃瓜苗期的猝倒病是由瓜果腐霉引起的[4～5]；猝倒病為茄類(lèi)蔬菜苗期常見(jiàn)病，常造成植株莖基部水浸狀，發(fā)軟變黃，由瓜果腐霉引起的蔬菜病害的相關(guān)報(bào)道很多。然而，針對(duì)豆芽瓜果腐霉的致病性及其防治方法的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)對(duì)腐霉菌引起的豆芽腐爛病癥狀進(jìn)行觀察及病癥進(jìn)行研究，分離、鑒定導(dǎo)致?tīng)€芽的致病菌屬，以期建立相應(yīng)生態(tài)、經(jīng)濟(jì)、有效的預(yù)防體系，為工廠化豆芽的安全生產(chǎn)提供理論與技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 豆芽病組織的采集與病原物的分離

圖1 瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）

2007年11月至2008年1月于規(guī)模化豆芽廠采集腐爛綠豆芽病害標(biāo)樣，采用常規(guī)的組織分離法[6]進(jìn)行病原物的分離培養(yǎng)。從樣品的腐爛部位切下病健交界處組織，首先置入70%酒精溶液中消毒處理30 s，再用無(wú)菌水清洗3遍，置于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，28℃連續(xù)培養(yǎng)7 d后鏡檢觀察菌絲、孢子囊和卵孢子的形態(tài)。

1.2 瓜果腐霉ITS區(qū)的克隆測(cè)序

將分離純化后的菌絲接種于PDA液體培養(yǎng)基中，28℃震蕩培養(yǎng)5～7 d，離心收集菌絲體。腐霉總DNA的提取采用改良二次沉淀法[7]。采用真菌通用引物 ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCT-3'） 和 ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'），以 腐 霉 總DNA為模板擴(kuò)增ITS區(qū)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94℃變性 5 min；94℃變性 1 min，52℃復(fù)性 1 min，72℃延伸 1 min，循環(huán)數(shù)為 35；72℃充分延伸 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收純化后分別連接EcoRⅤ酶切的克隆載體pBluescriptⅡ SK＋（Stratagene 公司），轉(zhuǎn)化 E.coli DH5α，并測(cè)序。

1.3 病原菌致病性檢測(cè)

發(fā)芽所用精選綠豆由豆芽廠提供，收獲于2007年，千粒質(zhì)量68 g。

瓜果腐霉在28℃避光條件下，V8培養(yǎng)基[8]上培養(yǎng)3～4 d后，向培養(yǎng)皿中加入無(wú)菌水，沒(méi)過(guò)菌絲，在顯微鏡下觀察到游動(dòng)孢子后；以四層紗布過(guò)濾收集孢子懸浮液；采用水培法，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗(yàn)，在浸種6 h后，分別用濃度為10個(gè)/mL（處理1）、102個(gè)/mL（處理 2）、103個(gè)/mL（處理 3）和 104個(gè)/mL（處理4）的孢子懸浮液各2 mL處理待發(fā)芽的綠豆5 min，設(shè)置一個(gè)空白對(duì)照處理，每個(gè)處理3次重復(fù)，從第2天開(kāi)始，每天定時(shí)測(cè)定不同處理豆芽（50根）的發(fā)病率和生物產(chǎn)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離、純化及形態(tài)學(xué)觀察

采用組織分離法[6]，對(duì)豆芽病組織進(jìn)行病原菌的分離、純化，可獲得純化的致病菌株。

PDA培養(yǎng)基28℃條件下培養(yǎng)，顯微鏡（40×）下形態(tài)學(xué)觀察，病原菌菌落呈放射狀，氣生菌絲棉絮狀，菌絲發(fā)達(dá)，分枝繁茂，孢子囊為膨大狀或瓣?duì)?，頂生或間生，泡囊球形。藏卵器球形，壁光滑。卵孢子球形，不滿器（圖1）。

2.2 病原菌的鑒定

采用病原菌ITS區(qū)序列系統(tǒng)發(fā)育分析方法，將得到的病原菌ITS區(qū)序列與GenBank中的序列進(jìn)行比較，利用分子生物學(xué)軟件分析二者之間的同源性并構(gòu)建發(fā)育樹(shù)（圖2）。由圖2可知，病原菌與腐霉屬中的Pythium aphanidermatum的一致性達(dá)到99%，這與形態(tài)學(xué)結(jié)果是吻合的，因此可以確定該病原菌為Pythium aphanidermatum。

2.3 瓜果腐霉的致病性檢測(cè)

用不同濃度梯度的孢子懸浮液處理綠豆芽，處理間的發(fā)病特征、發(fā)病率及生物產(chǎn)量存在極顯著差異（P＜1%）（圖3、圖4）。由圖3可知，用濃度為 104個(gè)/mL的菌液處理后豆芽發(fā)病最為嚴(yán)重，在第2天出現(xiàn)爛芽，第3天爛芽達(dá)58%，第4天發(fā)病率為100%；用103個(gè)/mL的菌液處理后豆芽發(fā)病較104個(gè)/mL的菌液處理輕，第4天爛芽達(dá)58%，第5天發(fā)病率為92%；而濃度為102個(gè)/mL菌液處理后，只有一個(gè)重復(fù)出現(xiàn)爛芽現(xiàn)象，第5天發(fā)病率為24%；濃度為10個(gè)/mL菌液處理后，豆芽健康，其發(fā)病率為0。由圖4可知，濃度為10個(gè)/mL和102個(gè)/mL菌液處理豆芽后，其生物產(chǎn)量與CK之間差異不顯著；濃度為103個(gè)/mL和104個(gè)/mL菌液處理豆芽后，生物產(chǎn)量與CK相比，存在極顯著差異，第3天生物產(chǎn)量開(kāi)始出現(xiàn)降低，第4天豆芽基本停止生長(zhǎng)，第5天生物產(chǎn)量分別降低10.3 g/50根，12.3 g/50根。

圖2 根據(jù)Pythium屬不同種類(lèi)的ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖3 不同濃度孢子懸浮液對(duì)綠豆芽發(fā)病率的影響

3 討論

3.1 關(guān)于瓜果腐霉菌的生物學(xué)特性研究

據(jù)報(bào)道，目前已知可侵染豆科、葫蘆科、茄科、百合科、禾本科等植株并且造成嚴(yán)重為害的腐霉主要有瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）、德里腐霉（Pythium deliense）、終極腐霉（Pythium ultimum）、群結(jié)腐霉（Pythium myriotylum）等。它們的主要形態(tài)特征是營(yíng)養(yǎng)體為無(wú)隔菌絲體，有的可形成菌絲膨大體和附著孢。無(wú)性繁殖從不分化的菌絲上產(chǎn)生孢子囊（游動(dòng)），呈絲狀、瓣?duì)?、球狀，有頂生、間生和切生多種著生方式；孢子囊與菌絲間常有一隔膜隔開(kāi)，游動(dòng)孢子在泡囊內(nèi)形成。而有性生殖則產(chǎn)生藏卵器、卵孢子和雄器[9]。本研究在顯微鏡下可清晰地觀察到瓜果腐霉的形態(tài)特征：無(wú)性繁殖產(chǎn)生孢子囊（游動(dòng)），孢囊梗與菌絲分化不明顯，呈裂瓣?duì)?，成熟后一般不脫落，萌發(fā)時(shí)形成泡囊；有性生殖產(chǎn)生卵孢子。有性生殖開(kāi)始時(shí)無(wú)隔菌絲頂端形成一個(gè)含有多個(gè)細(xì)胞核的配子囊。配子囊分為雄器（小，棍棒形）和藏卵器（大，球形）。這與前人對(duì)瓜果腐霉的生物學(xué)特性研究結(jié)果相一致。

3.2 關(guān)于瓜果腐霉對(duì)豆芽的致病性及病癥研究

圖4 不同濃度孢子懸浮液對(duì)綠豆芽生物產(chǎn)量的影響

國(guó)內(nèi)外不少學(xué)者對(duì)瓜果腐霉的致病性以及吸附與侵染做了大量工作，我國(guó)對(duì)于腐霉的研究開(kāi)始于俞大紱1934年研究黃瓜猝倒病的致病菌時(shí)，首次報(bào)道了第一個(gè)腐霉種瓜果腐霉。賀水山等[10]對(duì)瓜果腐霉游動(dòng)孢子侵染番茄和秋海棠的過(guò)程進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示游動(dòng)孢子主要附著在番茄苗根系的根毛區(qū)和根冠上，休止孢子萌發(fā)的芽管在侵入根毛之前，能形成附著孢或前侵染絲，而游動(dòng)孢子對(duì)秋海棠的附著主要集中在莖部和葉尖、葉緣處，芽管直接侵入莖、葉的表皮細(xì)胞及須根。陳婕等[4]在黃瓜苗期接種瓜果腐霉24 h后，病菌在胚軸皮層內(nèi)形成游動(dòng)孢子囊，孢子囊呈指形或裂瓣?duì)睿?8 h后在胚軸組織內(nèi)形成卵孢子，病胚軸表皮完全崩解。李永忠等[11]對(duì)番木瓜莖基腐病初步研究表明，瓜果腐霉以卵孢子或菌絲體隨病組織在土壤中越冬，成為初侵染源。在適宜的溫濕度條件下，潛伏于病組織和土壤中的病菌開(kāi)始生長(zhǎng)繁殖并形成孢子囊、釋放出游動(dòng)孢子，借風(fēng)雨、流水或人為傳播，引起發(fā)病。瓜果腐霉喜高溫高濕，最適溫度30～35℃，最高可耐溫度達(dá)45℃[12]，劉耕春等[13]對(duì)草坪禾草腐霉病研究表明，當(dāng)相對(duì)濕度高于90%，持續(xù)時(shí)間在14 h以上時(shí)，即可導(dǎo)致腐霉病的大發(fā)生。

關(guān)于瓜果腐霉對(duì)豆芽的侵染和致病性研究表明，在高溫高濕、避光、相對(duì)封閉的培育環(huán)境條件下，病菌滋生發(fā)展，其卵孢子萌發(fā)后產(chǎn)生游動(dòng)孢子，附著在芽體上侵染致??；再在發(fā)芽罐內(nèi)借助淋水和淋水濺射而傳播，又以游動(dòng)孢子作為再侵染接種體，侵染豆芽致病[14]，豆芽的瓜果腐霉病是否是由原料綠豆攜帶的瓜果腐霉卵孢子與菌絲體作為初侵染源，尚有待進(jìn)一步研究。

目前，關(guān)于瓜果腐霉的病癥研究主要集中在蔬菜作物。多數(shù)腐霉在各種土壤和水生環(huán)境中營(yíng)腐生而成為重要的植物病原菌，引起蔬菜成株期莖基部病害，出現(xiàn)水浸狀斑點(diǎn)，然后逐步擴(kuò)大為不規(guī)則斑塊，病組織慢慢變褐腐爛。另外，種子和幼苗在出土前也可腐爛失去萌發(fā)能力[9]，還能引起蔬菜貯藏期的腐爛。其對(duì)蔬菜的為害癥狀主要有3種情況：①侵染幼苗引起猝倒；②侵染根和莖部引起根部及其根莖基部腐爛；③成株期為害，在新播草坪的苗期也會(huì)有腐霉病的發(fā)生，導(dǎo)致幼苗猝倒和莖葉腐爛而枯死。濕度大時(shí)枯草團(tuán)周?chē)形锤癄€病株上布有蛛絲網(wǎng)般的綿毛狀菌絲體，手摸有粘滑感[15]。而在綠豆芽孵化培育過(guò)程中，百密一疏，有時(shí)可致孵化罐底部出現(xiàn)爛芽現(xiàn)象，發(fā)病芽體呈水浸狀，病體表面肉眼可見(jiàn)瓜果腐霉菌白色絲狀物，有淡淡的刺激性酸臭氣味。而室內(nèi)致病性研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)病芽體表面可見(jiàn)白色菌絲，感病組織呈淺褐色，顏色較深，且有較濃的刺激性臭味。這是否因?yàn)樯a(chǎn)中豆芽的淋水量較大，由于水的淋洗，使得病體組織的顏色較淺、氣味變淡，尚有待進(jìn)一步研究。

[1]康玉凡，陶禮明，毛振賓，等.工廠化豆芽成為現(xiàn)代加工食品新寵[J].長(zhǎng)江蔬菜，2008（9）:73-76.

[2]Dorrance A E,Berry S A,Bowen P.Characterization of Pythium spp.from three Ohio fields for pathogenicity on corn and Soybean and metalaxyl sensitivity[J].Plant Health Progress,2004（1）:202.

[3]Charles W.Root Rots of Green Beans and Lima Beans[C].Vegetable Disease Information Note 7(VDIN-007).

[4]陳婕，高洪敏.黃瓜腐霉菌苗期猝倒病致病機(jī)制研究[J].植物病理學(xué)報(bào)，1996，26（1）：55-61.

[5]底玉娟，馬國(guó)清.溫室蔬菜苗期猝倒病的發(fā)生與防治[J].農(nóng)業(yè)科技與信息，2005（2）：9.

[6]方中達(dá).植病研究方法（3版）[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1996.

[7]吳琦，王紅寧，劉世貴.三種黑曲霉細(xì)胞基因組DNA提取方法的比較[J].生物技術(shù)，2003，13（6）：30-31.

[8]李靜，張敬澤，吳曉鵬，等.鐵皮石斛疫病及其病原菌[J].菌物學(xué)報(bào)，2008，27（2）：172-177.

[9]張博，李長(zhǎng)松.蔬菜腐霉的研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2008，24（3）：313-318.

[10]賀水山，張炳欣.瓜果腐霉游動(dòng)孢子對(duì)番茄和秋海棠侵染過(guò)程的研究[J].植物病理學(xué)報(bào)，1992，22（2）：145-147.

[11]李永忠，楊媚，周而勛，等.番木瓜莖基腐病初步研究[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（12）：60-61.

[12]袁高慶，賴傳雅.南寧地區(qū)腐霉的生態(tài)分布及其生理性狀研究[D].南寧：廣西大學(xué)，2001.

[13]劉耕春，楊崇實(shí).草坪禾草腐霉病的發(fā)生與防治[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2001，7（3）：49-51.

[14]余永年，馬國(guó)忠.腐霉屬分類(lèi)性狀評(píng)價(jià)及其中國(guó)的種[J].真菌學(xué)報(bào)，1990，9（4）：249-262.

[15]王國(guó)良.影響冷季型草坪腐霉病發(fā)生因子的研究[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2000，12（3）：117-120.