劉中華，喬憲鳳，肖紅衛(wèi)，劉西梅，王華巖，鄭新民

1 西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院 陜西省干細胞工程技術(shù)研究中心 陜西省農(nóng)業(yè)分子生物學重點實驗室，楊凌 712100

2 湖北省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所 動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室，武漢 430064

雙鏈RNA (dsRNA) 引起的基因沉默或者RNA干擾 (RNAi) 是一種古老并且進化上保守的序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，廣泛存在于各種動物中[1-2]。目前在哺乳動物細胞中，主要應用兩種相關(guān)的技術(shù)來實現(xiàn)RNAi。一種方法是向哺乳動物細胞直接轉(zhuǎn)染人工合成的長度為19 bp并且 3′末端具有2個突出堿基的小干擾 RNA (siRNA)[3]，另一種方法是利用表達質(zhì)?；蛘卟《据d體在哺乳動物細胞中表達小發(fā)夾RNA (shRNA)[4-8]。前者只能引起短暫的干擾效應，而后者可以獲得穩(wěn)定而持久的基因沉默。

哺乳動物細胞轉(zhuǎn)入的siRNA超過30 bp時即會引起干擾素 (IFN) 效應和激活 RNA依賴的蛋白激酶 (PKR) 通路，從而導致細胞增殖受阻甚至凋亡[9]。自RNA干擾現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)以來，人們已經(jīng)對不同長度 (19~29 bp) 的siRNA沉默效應進行了相關(guān)研究。早期研究認為莖部長度為21 bp 的發(fā)夾結(jié)構(gòu)與細胞內(nèi)源的MicroRNA 結(jié)構(gòu)最為相近，基因沉默效應也最高。最近卻有研究發(fā)現(xiàn)，莖部長度為 27 bp或29 bp 時，引發(fā)的基因沉默效應可能顯著增加，甚至百倍于傳統(tǒng)的21 bp 莖環(huán)結(jié)構(gòu)[10-11]。本實驗以egfp為沉默效應的報告基因，分別構(gòu)建莖部長度為21 bp、27 bp、29 bp的干擾載體，經(jīng)純化后轉(zhuǎn)染小鼠胎兒成纖維細胞 (MEF) 和利用顯微注射法注射到小鼠胚胎的原核中，通過檢測其沉默效果來篩選出適合小鼠個體水平的最佳發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

小分子量 DNA片段高效快速純化回收試劑盒(Bio Dev公司)；B型超純質(zhì)粒小樣快速提取試劑盒(Bioteke公司)；siSTRIKE? U6 Hairpin Cloning Systems (Promega公司)；Taq酶 (Promega公司)；PstⅠ內(nèi)切酶(Fermentas)；脂質(zhì)體 Lipofectamine?2000 (Invitrogen公司)；DMEM 培養(yǎng)基(Gibco公司)；TRIzol Reagent RNA提取試劑盒 (Invitrogen公司)；RealMasterMix (Tiangen公司)；SuperscriptⅡ反轉(zhuǎn)錄酶 (Invitrogen公司)；熒光顯微鏡 (Olympus)；iQ5熒光定量PCR儀 (Biorad公司)；冷凍離心機 (Sigma公司)。

1.2 RNAi表達載體構(gòu)建

1.2.1 寡核苷酸設計合成

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫提供的pEGFP-C1載體序列(Accession No. 1377914)，以其上攜帶的增強型綠色熒光蛋白基因 (egfp) 為目的基因，利用Promega公司在線設計程序設計莖部長度分別為21 bp、27 bp、29 bp的干擾片段 (其序列及結(jié)構(gòu)見圖1和表1)，

表1 不同長度莖部的shRNA序列Table 1 shRNA sequences with different length of stem

圖1 shRNA載體構(gòu)建Fig. 1 Construction of shRNA vector.

經(jīng) BLAST比對證實與小鼠基因組其他序列無同源性。每一長度包括3條干擾片段和1條陰性對照序列，其環(huán)部結(jié)構(gòu)均使用9 bp序列 (TTCAA GAGA)，送交Invitrogen公司合成。psiSTRIKE載體本身具有單一的PstⅠ酶切位點，設計的干擾片段3′端與其連接后會生成一個新的PstⅠ酶切位點，可以此做酶切鑒定陽性克隆 (圖1)。

1.2.2 shRNA表達載體構(gòu)建

用dd H2O將合成的寡核苷酸 (oligos) 稀釋成1 μg/μL。然后進行退火，反應體系 (50 μL)：退火B(yǎng)uffer (46 μL)+正義鏈oligos (2 μL)+反義鏈oligos (2 μL)；退火程序：90 ℃ 3 min，37℃ 15 min。將退火后的核苷酸稀釋到4 ng/μL，與psiSTRIKE載體在T4 DNA連接酶作用下過夜連接。產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 DH5α感受態(tài)細胞，在含氨芐青霉素 (100 μg/μL) 的 LB平板上篩選。次日挑取陽性克隆，在含氨芐青霉素(100 μg/μL) 的LB 液體培養(yǎng)基中250 r/min、37℃振蕩培養(yǎng)14~16 h，小量提取質(zhì)粒，隨后PstⅠ酶切4 h，1%瓊脂糖電泳鑒定。陽性克隆載體送 Invitrogen測序驗證后，B型超純質(zhì)粒小樣快速提取試劑盒進行回收，用于真核細胞轉(zhuǎn)染和原核顯微注射。

1.3 細胞培養(yǎng)與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染

1.3.1 小鼠胎兒成纖維細胞的分離及培養(yǎng)

轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白基因小鼠自然交配，待雌鼠妊娠13.5 d時將其處死。取出胎兒，0.25%胰酶消化取其細胞，高糖DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng) (添加10% FBS、1%青鏈霉素)。然后對其進行傳代純化、細胞計數(shù)、凍存等操作。在倒置熒光顯微鏡下觀察熒光表達情況，并照相。

1.3.2 細胞轉(zhuǎn)染

24孔轉(zhuǎn)染法，按Lipofectamine 2000說明書操作。待細胞生長至 60%~70%匯合度時進行轉(zhuǎn)染，每孔添加0.4 μg環(huán)狀shRNA表達質(zhì)粒和2 μL脂質(zhì)體。分別于轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h在熒光顯微鏡下觀察沉默效應。

1.3.3 穩(wěn)定細胞株的獲得

轉(zhuǎn)染48 h后更換含G 418 (500 μg/mL) 的完全培養(yǎng)基進行穩(wěn)定細胞株的篩選，之后每3天更換培養(yǎng)液。大約15 d抗性細胞集落形成，此時用含半量篩選濃度 (250 μg/mL) 的G 418完全培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)。

1.4 熒光定量PCR檢測干擾效果

1.4.1 細胞總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

分別于轉(zhuǎn)染24 h、48 h、72 h收集24孔板培養(yǎng)的細胞，參照TRIzol Reagent RNA提取試劑盒使用說明書進行細胞總 RNA的提取。紫外分光光度計測定RNA的濃度及純度。取4 μg總RNA、1 μL Oligo (dT)12-18、1 μL dNTPs (10 mmol/L)、RNase-free ddH2O定容至12 μL，混合后65℃溫浴5 min，置冰上冷卻 2 min，簡短離心后依次加入 4 μL 5×First-Strand Buffer、2 μL 0.1 mol/L DTT、1 μL RNasin，混勻，42℃溫浴2 min。加入1 μL SuperScript II 反轉(zhuǎn)錄酶，混勻后42℃溫浴50 min，70 ℃ 15 min 終止反應。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于?20℃保存或立即進行PCR。

1.4.2 引物和探針設計及合成

利用Primer Express軟件，分別針對pEGFP-C1載體上的 egfp和小鼠的 gapdh (Accession No. 126012538) 基因設計用于熒光定量 PCR的引物及探針 (表2)，送交Invitrogen公司合成。

1.4.3 熒光定量PCR反應

從空白組、EGFP-21 siRNA組、EGFP-27 siRNA組、EGFP-29 siRNA組、陰性對照組的cDNA中各取1 μL作為模板，參照說明書配制25 μL反應體系：10 μL 2.5×RealMasterMix，gapdh和egfp上游引物及下游引物各 1 μL，探針各 0.5 μL，1.25 μL 20×probe，7.75 μL ddH2O。反應在Biorad公司iQ5熒光定量PCR儀上進行，擴增條件如下：95 ℃ 2 min，95℃ 20 s，57℃ 20 s，68℃ 30 s，共40個循環(huán)。待獲得各樣品的Ct值后，使用2?△△Ct法[12]分析結(jié)果。

表2 用于熒光定量PCR分析的引物及探針序列Table 2 Primer and probe sequences used for real-time PCR analysis

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒酶切鑒定

提取的質(zhì)粒DNA用PstⅠ酶切，陽性質(zhì)粒將被酶切成2個片段，長度分別為3655 bp和962~970 bp (因莖部長度而異)，其酶切片段電泳結(jié)果如下 (圖2) 所示。

圖2 重組質(zhì)粒PstⅠ酶切Fig. 2 Recombinant plasmid digested with PstⅠ . M1: DL 2000 marker; 1: positive control; 2–4: positive plasimid; M2: Hind Ⅲ marker.

2.2 重組質(zhì)粒的測序驗證

酶切鑒定呈陽性的重組質(zhì)粒送上海英駿生物技術(shù)公司測序驗證。ClustalX軟件將測序結(jié)果與設計的序列進行比對，所含目的基因序列準確無誤，證明已獲得所需的重組質(zhì)粒。

2.3 轉(zhuǎn)染細胞的顯微鏡觀察

轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白小鼠胎兒成纖維細胞均貼壁生長，大多呈梭形或多角形；熒光顯微鏡下觀察，細胞發(fā)出強烈的綠色熒光 (圖3 A、B)。shRNA表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞24 h后出現(xiàn)熒光減弱現(xiàn)象，48 h沉默效應達到最大。加入G 418篩選，細胞于第3 天開始大量死亡，15 d左右出現(xiàn)單細胞克隆，然后分化成生長期細胞群。篩選7 d時給細胞照相，轉(zhuǎn)不同莖部長度 (21 bp、27 bp、29 bp) shRNA表達質(zhì)粒的細胞均出現(xiàn)沉默現(xiàn)象 (圖3 C、D、E、F、G、H)，箭頭所示細胞在白光下可見，在紫外光下發(fā)出微弱熒光或者不可見，陰性對照組沒有發(fā)現(xiàn)相應效應(圖3 I、J)。

2.4 熒光定量PCR結(jié)果分析

利用 TaqMan探針法對轉(zhuǎn)染不同莖部長度干擾載體的細胞cDNA進行熒光定量PCR檢測。每組設3個重復，取其平均值，利用 2?△△Ct對其數(shù)據(jù)進行分析 (表3)。從表3可以看出，莖部長度為21 bp、27 bp和29 bp的shRNA表達載體分別使得綠色熒光蛋白基因的表達量降低了55%、60%和78%，以莖部長度29 bp的干擾載體沉默效果最好；不同莖部長度的干擾載體使得目的基因出現(xiàn)最大沉默效應的時間也不同，21 bp、27 bp或29 bp分別是在轉(zhuǎn)染后24 h和48 h。

圖3 小鼠胎兒成纖維細胞的顯微鏡觀察Fig. 3 Microscopy of mouse fibroblast.(A, B) MEF separately exposed under light and UV. (C, D) MEF transfected by EGFP-21 siRNA separately exposed under light and UV. (E, F) MEF transfected by EGFP-27 siRNA separately exposed under light and UV. (G, H) MEF transfected by EGFP-29 siRNA separately exposed under light and UV. (I, J) MEF transfected by scramble sequence separately exposed under light and UV.

表3 2?△△Ct法分析的干擾結(jié)果Table 3 Result analysed by 2?△△Ct method

3 討論

質(zhì)粒 DNA的拓撲學結(jié)構(gòu)對其轉(zhuǎn)染效率影響很大。Andrea等[13]分別用表達半乳糖苷酶的線性化和環(huán)化質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Vero細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)前者與脂質(zhì)體形成的復合物轉(zhuǎn)化效率明顯低于后者，究其原因在于線性化和環(huán)化 DNA與脂質(zhì)體形成的復合物空間結(jié)構(gòu)不同。李作生等[14]利用不同拓撲學結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)化E. coli感受態(tài)細胞、轉(zhuǎn)染SK 6-6細胞和免疫小鼠，結(jié)果表明轉(zhuǎn)化原核細胞和轉(zhuǎn)染真核細胞時，環(huán)化質(zhì)粒是線性化質(zhì)粒效率的幾十倍，超螺旋比例高的基因疫苗免疫效果明顯好于開環(huán)質(zhì)粒的基因疫苗。為了獲得最大的轉(zhuǎn)染效率，本實驗中用于轉(zhuǎn)染細胞的沉默載體均未線性化。

2002年，Hasuwa等[6]首先利用顯微注射法將莖部長度為21 bp的shRNA干擾載體導入轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白小鼠的雄原核中，成功獲得了 RNAi小鼠，證明 RNA 干擾技術(shù)用于轉(zhuǎn)基因動物研究的可行性。雖然研究者針對不同目的基因，利用不同方法來研究沉默效應，但至今仍未見報道利用轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白小鼠成體細胞來研究干擾效應的文章。本實驗中，轉(zhuǎn)染細胞的顯微鏡觀察和實時熒光定量PCR分析結(jié)果顯示，雖然不同莖部長度的shRNA載體轉(zhuǎn)染MEF后均發(fā)生了綠色熒光蛋白沉默現(xiàn)象，但是其抑制基因表達的程度有所不同：21 bp和27 bp莖部長度的干擾效應相差不大，29 bp莖部長度的干擾效應明顯優(yōu)于二者。Kim等[10]研究發(fā)現(xiàn) 27 bp的 siRNA可作為Dicer底物進入RNAi途徑，在很低的濃度下 (50~200 pmol) 效果比21 bp的siRNA更好，持續(xù)時間更長。同年，Siolas等[11]報道體外合成的29 bp shRNA可被Dicer切割成22 bp的小片段RNAs，能引起更加強烈的RNA干擾效應。本實驗將設計的不同莖部長度 shRNA基因序列克隆進入真核表達載體，以期獲得更加穩(wěn)定、長期的基因沉默效應。此次實驗的初步結(jié)果與 Siolas等的研究相一致，但卻并沒有獲得27 bp較21 bp shRNA具有明顯干擾效應的數(shù)據(jù)。這可能與干擾載體的用量有關(guān)，因為不同莖部長度的 siRNA產(chǎn)生最佳沉默效應的濃度不同[10]；也有可能跟目的基因本身序列結(jié)構(gòu)有關(guān)。真正原因仍需進一步實驗探明。

另外作者在分析了實驗數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)不同莖部長度的干擾載體雖然都使得目的基因出現(xiàn)了沉默，但達到最大效應的時間有所不同。Kim等[10]利用體外合成的長度分別為21 bp和27 bp的dsRNA轉(zhuǎn)染細胞，結(jié)果二者均在轉(zhuǎn)染后的第4天達到最大沉默效應。最佳沉默效應發(fā)生在時間上的差異，可能與siRNA的導入形式以及轉(zhuǎn)染細胞系的不同有關(guān)。

為了進一步驗證干擾效應，利用原核顯微注射法將制備的干擾質(zhì)粒注射到小鼠受精卵雄原核中。胚胎體外培養(yǎng)到兩細胞期，可見明顯的干擾效應，但并未進一步發(fā)育。顯微注射外源DNA本身會對胚胎發(fā)育有一定影響，而且DNA濃度過高對胚胎也有毒害作用[15]。Hasuwa等[6]利用顯微注射法將干擾載體導入小鼠原核并體外培養(yǎng)到桑椹胚，說明顯微操作熟練程度可能是導致培養(yǎng)的胚胎發(fā)育受阻的主要原因。

雖然人們普遍認為向哺乳動物細胞導入 siRNA (＜30 bp) 長度過短時不會引起干擾素效應，但有研究表明向哺乳動物細胞轉(zhuǎn)入小片段siRNA或者構(gòu)建的 shRNA載體一樣可以引發(fā)干擾素效應[16-17]。當siRNA片段數(shù)量足夠大時，還可與核胞質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白exportin-5結(jié)合從而飽和其通路，影響內(nèi)源性miRNAs的作用[18]。因此，siRNA除了使目的基因沉默外，還存在一個錯綜復雜的負效應網(wǎng)絡，有待深入研究。

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