蔡鑫澤，喬瑩，都姝妍，劉楠，陳冬，車(chē)睿超，姜奕

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng) 110001）

反相高效液相色譜法測(cè)定人乳腺癌MCF7細(xì)胞中基因組DNA甲基化水平

蔡鑫澤，喬瑩，都姝妍，劉楠，陳冬，車(chē)睿超，姜奕

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng) 110001）

目的 利用反相高效液相色譜法檢測(cè)MCF7細(xì)胞系中基因組DNA的甲基化水平。方法 采用Nano LC（75μm×15cm，5μm）和 Micro LC（1.0mm×15cm，5μm）的 C18反相色譜柱，以甲醇-醋酸銨緩沖液（pH5.0）為流動(dòng)相，使用線性梯度程序，將MCF7細(xì)胞中基因組DNA水解產(chǎn)物進(jìn)行分離，兩種體系流速分別是300nl/min和40μl/min，在273nm波長(zhǎng)處檢測(cè)，利用外標(biāo)法分別檢測(cè)DNA中脫氧胞嘧啶（dC）和甲基化脫氧胞嘧啶（5mdC）含量。結(jié)果 MCF7基因組DNA的水解產(chǎn)物，經(jīng)反相色譜分離得到的峰圖有較好的準(zhǔn)確性與重復(fù)性；DNA水解后的產(chǎn)物為弱保留化合物，且Micro LC分離效果優(yōu)于Nano LC；乳腺癌細(xì)胞MCF7甲基化水平為19.3%，高于正常細(xì)胞中基因組DNA甲基化水平。結(jié)論 成功的將MCF7細(xì)胞中基因組DNA水解產(chǎn)物經(jīng)反相色譜分離；使用Micro LC分離DNA水解后的弱保留產(chǎn)物較佳；MCF7細(xì)胞系基因組DNA甲基化水平高于正常細(xì)胞。

反相高效液相色譜法；基因組；甲基化水平；乳腺癌

植物和動(dòng)物體內(nèi)基因組DNA廣泛的甲基化，已被作為其不同生理?xiàng)l件下表觀作用的一個(gè)標(biāo)識(shí)［1］。常用的分析方法主要是配有紫外檢測(cè)的高效液相色譜（HPLC）和毛細(xì)管電泳（CE）［2］，HPLC結(jié)合電噴霧質(zhì)譜（ESI-MS）聯(lián)用技術(shù)也越來(lái)越常用，目前反相高效液相色譜技術(shù)被公認(rèn)為檢測(cè)核苷酸、堿基的理想方法［3］。

近年來(lái)的研究表明，DNA的甲基化水平與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［4］，因此甲基化的程度與狀態(tài)為臨床腫瘤等疾病的診療提供了可信的科學(xué)數(shù)據(jù)。本研究利用反相高效液相色譜法對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF7基因組DNA的甲基化水平進(jìn)行檢測(cè)，建立研究DNA甲基化的色譜技術(shù)平臺(tái)，為進(jìn)一步的研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

戴安公司Ultimate3000高效液相色譜儀（美國(guó)Dionex公司，包括WPS-3000自動(dòng)進(jìn)樣閥、VWD-3400RS可調(diào)波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器、FLM-3100柱溫箱、DGP-3600M壓力泵），溶劑過(guò)濾系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）、安瓿瓶（美國(guó)Agilent公司）。

堿基標(biāo)準(zhǔn)品（購(gòu)自美國(guó)Sigma公司）：脫氧胞嘧啶（dC）和甲基化脫氧胞嘧啶（5mdC）；甲醇為色譜純（德國(guó)Merck公司）；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水；醋酸銨、核酸酶P1、DNA酶Ⅰ、RNA酶A購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；堿性磷酸酶購(gòu)自美國(guó)NEB公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取與水解：體外培養(yǎng)乳腺癌MCF7細(xì)胞的DNA采用QIAamp DNABlood Mini Kit提取試劑盒（德國(guó)Qiagen公司）提取后，用終濃度為10μg/ml的RNA酶A去除含有的RNA；DNA水解過(guò)程參照已有文獻(xiàn)［5］的方法：10μg DNA溶于10μl Tris-Cl（25mmol/L，pH8.0），10U的 DNA酶Ⅰ在 37℃處理1h，再100℃變性3min，迅速于冰上冷卻10min，加入1μl核酸酶P1后放入37℃水浴中16h，然后加入堿性磷酸酶1.5U處理2h，于-20℃保存。1.2.2 高效液相色譜條件：戴安Ultimate3000型HPLC系統(tǒng)，色譜柱為戴安公司 Nano LC（75μm×15cm，5μm 粒徑）和 Micro LC（1.0mm×15cm，5μm 粒徑）的C18反相柱。流動(dòng)相：A，去離子水；B，50mmol/L醋酸銨（pH5.0）；C，甲醇。用于分離的梯度程序：0～20min 0～30%C（線性梯度），15%B；20～25min 30%C，15%B；25～50min 15%B，85%A（V/V）。柱溫30℃。檢測(cè)波長(zhǎng)270nm。流速：Nano LC體系流速為 300nl/min，Micro LC體系流速為 40μl/min。進(jìn)樣量 0.2μl。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：根據(jù)人類(lèi)基因組DNA甲基化水平約為5%［6］，因此將購(gòu)買(mǎi)的標(biāo)準(zhǔn)品5mdC和dC按照質(zhì)量濃度比1∶20配制。其中5mdC質(zhì)量濃度系列為：1、2、4、8ng/μl，dC質(zhì)量濃度系列為：20、40、80、160ng/μl。利用優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件，進(jìn)樣量為0.2μl。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理軟件為Chromeleon Version 6.80（美國(guó)Dionex公司）；采用外標(biāo)法定量，以W（5mdC）/［W（dC）+W（5mdC）］100%（單位為 ng/ng DNA）的方式來(lái)表征DNA甲基化水平。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中dC和5mdC各自的含量，然后通過(guò)公式：（5mdC）%=W（5mdC）/［W（dC）+W（5mdC）］100%，得出MCF7細(xì)胞系DNA甲基化水平。

2 結(jié)果

2.1 反相色譜分離條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)用的兩個(gè)C18反相柱分別是戴安公司的Nano和Micro柱，即柱子的直徑為75μm和1.0mm，已經(jīng)測(cè)試合格，并具有較佳的柱效。對(duì)于流動(dòng)相的選擇，本研究用醋酸銨-甲醇、酸化甲醇-甲酸、醋酸銨-乙腈溶液等多種流動(dòng)相進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明以醋酸銨-甲醇溶液得到的分離效果最好。將已稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品dC和5mdC為樣品進(jìn)行分離條件的優(yōu)化，當(dāng)線性梯度洗脫條件為：0～20min，0～30%甲醇，7.5%醋酸銨時(shí)，dC與5mdC可以達(dá)到完全分離（圖1）?？梢钥闯?，采用Micro LC體系的分離圖，峰寬較窄，分辨率較高，分離效果明顯優(yōu)于Nano LC體系，故以后實(shí)驗(yàn)采用Micro LC體系。

2.2 線性關(guān)系的考察

將5mdC和dC的母液按1∶20的質(zhì)量比混合，再逐級(jí)稀釋至濃度分別為 1、2、4、8ng/μl和 20、40、80、160ng/μl。實(shí)驗(yàn)采用 Micro LC體系，使用的定量方法為外標(biāo)法。將各稀釋液分別進(jìn)樣0.2μl進(jìn)行檢測(cè)，以濃度為橫坐標(biāo)，積分面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2），相關(guān)系數(shù)r分別為99.82%和99.89%。

2.3 方法的準(zhǔn)確性與重復(fù)性

實(shí)驗(yàn)采用人乳腺癌細(xì)胞MCF7基因組DNA水解產(chǎn)物作為質(zhì)量控制樣品，對(duì)本方法的準(zhǔn)確性和重復(fù)性進(jìn)行了研究。取平行樣品在同一天內(nèi)不同時(shí)間以及同一樣品在不同天數(shù)進(jìn)行重復(fù)測(cè)試，結(jié)果表明5mdC和dC測(cè)定值平行樣相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差、樣品的日內(nèi)偏差和日間偏差（RSD）范圍在2%～5%（表1），表明本方法具有良好的重復(fù)性。

表1方法準(zhǔn)確性和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ta b.1Ac c u r a c y a n d r e p e a t a b i l i t y o f t h e me t h o d Result 5mdC（ng/μl） RSD%（n=4） dC（ng/μl） RSD%（n=4）Parallel sample 1.698±0.02 2.35 7.075±0.06 2.17Intra-day 1.665±0.03 3.38 7.112±0.025 3.21Inter-day 1.710±0.053 5.10 7.230±0.04 4.86RSD，relative standard deviation.Plus-minus values are means±SD.

2.4 MCF7細(xì)胞系DNA甲基化水平檢測(cè)

利用上述分析方法對(duì)人乳腺癌MCF7細(xì)胞內(nèi)基因組DNA甲基化水平進(jìn)行檢測(cè)，將標(biāo)準(zhǔn)品與樣品MCF7的水解產(chǎn)物進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)品的兩個(gè)峰圖即dC與5mdC與樣品中的兩個(gè)峰匹配完好，可得到各自的保留時(shí)間：dC為5.747min，5mdC為7.753min（圖3）；同時(shí)，將該結(jié)果圖整理得到表2。最后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出樣品中的dC和5mdC的含量，進(jìn)而得出MCF7細(xì)胞系DNA甲基化水平為19.3%。

表2整理得到的樣品峰圖信息表Ta b.2In f o r ma t i o n s h e e t o f s a mp l e p e a k s No.Retention time（min）Peak NameHeight（mAU）Area（mAU·min）Relative area（%）Amoun（ng/μl）15.75 dC 37.778 4.744 18.46 7.08527.75 5mdC 9.018 1.162 4.52 1.692

3 討論

近幾年，表觀遺傳學(xué)改變的研究取得了長(zhǎng)足進(jìn)展，成為腫瘤臨床基礎(chǔ)研究的一個(gè)熱點(diǎn)領(lǐng)域。表觀遺傳學(xué)是研究非DNA序列變化引起的基因表達(dá)的改變，是研究表達(dá)在時(shí)間和空間上的調(diào)控問(wèn)題，其中最主要的研究?jī)?nèi)容就是DNA甲基化［7］。

DNA甲基化修飾是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶作用下，以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到胞嘧啶和鳥(niǎo)嘌呤（CpG）二核苷酸的胞嘧啶5位碳原子上，癌基因多為不充分甲基化，導(dǎo)致表達(dá)異常；抑癌基因多為過(guò)度甲基化，導(dǎo)致表達(dá)不足［8～10］。對(duì)腫瘤DNA甲基化的研究，應(yīng)根據(jù)目的選擇合適的方法，明確是研究整體水平的甲基化還是研究特定位點(diǎn)的甲基化。對(duì)DNA中CpG島的甲基化分析涉及多種分子生物學(xué)方法，如甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶方法、NaHSO3法（包括BSP測(cè)序法、甲基化特異性PCR、熒光定量法）、芯片技術(shù)等。對(duì)DNA整體甲基化水平的研究，主要靠的是高效液相色譜、質(zhì)譜等精密儀器［11］。可見(jiàn)，研究基因組DNA甲基化的方法多種多樣，一方面說(shuō)明甲基化研究難度大，另一方面也說(shuō)明這些方法都存在著局限性。

本次研究通過(guò)采用反相色譜技術(shù)對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF7中基因組DNA甲基化水平的檢測(cè)，成功將DNA水解產(chǎn)物進(jìn)行分離、定量。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，DNA水解產(chǎn)物對(duì)于C18反相柱為弱保留化合物，流動(dòng)相選用甲醇-醋酸銨緩沖液較為合適；比較Micro LC和Nano LC的分離圖譜，雖然二者都足以達(dá)到分離效果，但前者可以得到較窄的峰寬圖，因此其分離效果要優(yōu)于Nano LC；對(duì)MCF7細(xì)胞系甲基化的總體水平定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，反相HPLC可以得到較佳的分析重現(xiàn)性，樣品定量結(jié)果表明，MCF7基因組甲基化水平高于正常細(xì)胞，推測(cè)該細(xì)胞系中的部分抑癌基因甲基化程度過(guò)度異常，導(dǎo)致抑癌基因表達(dá)下降，使腫瘤發(fā)生。

總之，建立基于高效液相色譜（HPLC）技術(shù)的DNA甲基化研究平臺(tái)，可以為今后進(jìn)一步研究某種基因甲基化的特定位點(diǎn)奠定基礎(chǔ)，此外，深入研究DNA甲基化與基因表達(dá)的關(guān)系及作用機(jī)制為腫瘤的早期診斷與臨床治療提供了新的思路。

［1］Fieldes MA，Schaeffer SM，Krech MJ，et al.DNAhypomethylation in 5-azacytidine-induced early-flowering lines of flax ［J］.Theor Appl Genet，2005，111（1）：136-149.

［2］Johnston JW，Harding K，Bremmer DH，et al.HPLCstudy of plant DNAmethylation：Astudy of critical methodological factors［J］.Plant Physiol Biochem，2005，43（9）：844-853.

［3］王超云，胡鳳祖，師治賢.反相高效液相色譜法測(cè)定大鼠肝組織中 DNA的堿基含量［J］.色譜，2002，20（4）：348-349.

［4］Martens JW，Margossian AL，Schmitt M，et al.DNAmethylation as a biomarker in breast cancer ［J］.Future Oncol，2009，5（8）：1245-1256.

［5］Liu ZF，Wu JJ，Xie ZL，et al.Quantification of regional DNAmethylation by liquid chromatography/tandem mass spectrometry［J］.Anal Biochem，2009，391（2）：106-113.

［6］Friso S，Choi SW，Dolnikowski GG，et al.Amethod to assess genomic DNAmethylation using high-performance liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry ［J］.Anal Chem，2002，74（17）：4526-4531.

［7］朱新江，孟春風(fēng)，彭過(guò)，等.5-Aza-dC和TSA對(duì)胃癌細(xì)胞系p16和hMLH-1基因甲基化水平及表達(dá)的影響 ［J］.世界華人消化雜志，2008，16（17）：1837-1841.

［8］Van der Auwera I，Yu W，Suo L，et al.Array-based DNAmethylation profiling for breast cancer subtype discrimination ［J］.PLoSOne，2010，5（9）：e12616.

［9］張曄，曲秀娟，劉云鵬，等.3種胃癌細(xì)胞株中GSTP1基因表達(dá)及其啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)的研究［J］.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，37（6）：724-726.

［10］Chuang CK，Chu DC，Tzou RD，et al.Hypermethylation of the CpGislands in the promoter region flanking GSTP1gene is a potential plasma DNAbiomarker for detecting prostate carcinoma［J］.Cancer Detect Prev，2007，31（1）：59-63.

［11］孫貝娜.DNA甲基化檢測(cè)方法的研究進(jìn)展［J］.生命科學(xué)儀器，2009，7（4）：11-14.

（編輯 裘孝琦，英文編輯 陳 姜）

Genomic DNAMethylation in Human Breast Cancer Cell Line MCF7Detected by Reversed-phase High Performance Liquid Chromatography

CAIXin-ze，QIAOYing，DUShu-yan，LIUNan，CHENDong，CHERui-chao，JIANGYi
（Central Laboratory，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo detect the genomic DNAmethylation in human breast cancer cell line MCF7with reversed-phase high performance liquid chromatography（HPLC）.MethodsThe products of genomic DNAhydrolysis in MCF7cells were chromatographed on Nano LC（75μm×15cm，5μm）and Micro LC（1.0mm×15cm，5μm）with ultraviolet detection at 270nm，and eluted by the mobile phase of MeOH-NH4Ac （pH5.0）at the flow rates of 300nl/min and 40μl/min under the condition of linear gradient program.The amounts of 2′-deoxycytidine （dC）and 5-methyl-2′-deoxycytidine （5mdC）were determined by external standard method.ResultsThe products of DNAhydrolysis were successfully separated by reversed-phase HPLCwith good repeatability and accuracy.The products were weakly retained and separated better by Micro LC.The level of global DNAmethylation in MCF7cells was 19.3%，which was higher than that in normal cells.ConclusionThe products of DNAhydrolysis in MCF7cells could be successfully separated by reversed-phase HPLC.Micro LCis superior to Nano LCin separating weak retention compounds of hydrolysis products.The level of DNAmethylation is higher in MCF7cells than in normal cells.

reversed-phase high performance liquid chromatography；genome；methylation level；breast cancer

O657.72；Q523

A

0258-4646（2010）11-0898-03

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30571701）

蔡鑫澤（1982-），男，助教，碩士.

姜奕，E-mail：yjiang58@hotmail.com

2010-07-30