王明，王連渠，譚毅

（重慶醫(yī)科大學 附屬第一醫(yī)院泌尿外科，重慶 400016）

野生型p53基因調(diào)控膀胱移行細胞癌中心體異常的實驗研究

王明，王連渠，譚毅

（重慶醫(yī)科大學 附屬第一醫(yī)院泌尿外科，重慶 400016）

目的 研究野生型p53基因抑制膀胱癌細胞中心體異常的作用。方法 將野生型p53基因重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染人膀胱癌細胞T24，應(yīng)用免疫熒光化學法檢測膀胱癌細胞中心體異常變化情況。結(jié)果 野生型p53基因可抑制膀胱移行細胞癌T24細胞中心體異常。結(jié)論p53基因可能是膀胱移行細胞癌中心體異常的一個重要調(diào)控因子，p53基因失活可能引起腫瘤細胞染色體不穩(wěn)，從而促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

野生型p53基因；膀胱癌細胞株；中心體異常；染色體不穩(wěn)

中心體異常是惡性腫瘤細胞的一個重要特征，它引起腫瘤細胞極性的改變和細胞的異常分裂如多極分裂，從而導(dǎo)致染色體分離異常（非整倍體），使腫瘤細胞表現(xiàn)為復(fù)雜的染色體和基因組改變，并隨著腫瘤的發(fā)生、發(fā)展而不斷的向更復(fù)雜的方向演變。中心體異常已經(jīng)成為近年來研究的熱點。中心體正常的結(jié)構(gòu)、功能和復(fù)制的維系有賴于多個調(diào)控因子之間的協(xié)調(diào)。野生型p53基因是一種與人類腫瘤相關(guān)性最高的抑癌基因，有研究報道p53蛋白也是中心體異常的一個重要調(diào)控因子。本研究通過轉(zhuǎn)染野生型p53基因?qū)Π螂滓菩屑毎╞ladder transitional cell carcinoma，BTCC）T24細胞系細胞中心體異常的變化進行研究和分析，以探討p53對BTCC細胞中心體的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象、主要試劑和染色方法

BTCCT24細胞系，由本實驗室保存；野生型p53基因重組腺病毒載體（Ad-CMVp53）和含有綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的對照載體（AdCMV-GFP），由國家人類基因組北方研究中心提供，病毒滴度為5×1010IFU/ml。第一抗體單克隆鼠抗人γ微管蛋白抗體（GTU88）、單克隆鼠抗人p53抗體（DO-1），美國Sigma公司產(chǎn)品；第二抗體FITC標記山羊抗鼠IgG、SP-9002免疫組化染色試劑盒、碘化丙錠（PI）、DAB顯色試劑盒、封閉用正常山羊血清工作液、包被玻片用多聚賴氨酸，均為北京中杉金橋生物試劑公司產(chǎn)品。

1.2 細胞培養(yǎng)

應(yīng)用RPMI1640培養(yǎng)基（含10%小牛血清、100IU/ml青霉素、0.2mg/ml鏈霉素），在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱、載玻片24孔板中培養(yǎng)。細胞大體生長狀態(tài)在倒置顯微鏡下觀察，當玻片80%～90%為細胞貼壁覆蓋時，收獲載玻片。

1.3 病毒轉(zhuǎn)染

先用AdCMV-GFP做預(yù)實驗，用不同稀釋倍數(shù)的AdCMV-GFP感染細胞，在感染1～2d后檢測感染效率。通過在熒光顯微鏡下觀察細胞的GFP的表達情況來確定，可達到100%感染效率但又不會引起細胞表型變化病毒濃度范圍。將細胞接種于放有1cm×1cm載玻片的24孔板中，24h后換液，并加入Ad-CMVp53和AdCMV-GFP，同時設(shè)立空白對照組，24h后再換液，繼續(xù)培養(yǎng)2d，分別進行轉(zhuǎn)染的鑒定和中心體的檢測。

1.4 轉(zhuǎn)染的鑒定

1.4.1 腺病毒轉(zhuǎn)染的效率：在熒光顯微鏡下，通過觀察轉(zhuǎn)染對照腺病毒AdCMV-GFP的細胞GFP的表達情況來確定腺病毒轉(zhuǎn)染的效率。

1.4.2 野生型p53蛋白表達：用免疫細胞化學法檢測Wtp53蛋白表達來檢測野生型p53蛋白表達，檢測使用的抗體為單克隆鼠抗人p53抗體，光鏡下觀察，同時培養(yǎng)的未轉(zhuǎn)染的T24細胞做對照。

1.5 應(yīng)用免疫熒光細胞化學法檢測中心體

將含有細胞的載玻片經(jīng)PBS清洗，多聚甲醇溶液固定，空氣干燥，PBS再水化，山羊血清封閉，加入單克隆鼠抗γ微管蛋白抗體∶阻滯液（1∶40）孵育，PBS清洗，F(xiàn)ITC標記山羊抗鼠IgG∶阻滯液（1∶50）孵育，PBS清洗，PI副染，PBS清洗。染色完成后的切片立即置于熒光顯微鏡下觀察，不能及時觀察的玻片置于4℃冰箱內(nèi)避光保存。同時隨機抽取2～4張玻片，以PBS代替一抗的同步染色作為陰性對照。

1.6 結(jié)果判斷

中心體異常陽性的判定：熒光顯微鏡下觀察，正常膀胱黏膜上皮細胞具有典型的一個或一對中心體。BTCC細胞中經(jīng)?？梢姷蕉鄠€巨大或者畸形的中心體。我們把具有以下特征之一的中心體判斷為異常中心體：（1）1個細胞內(nèi)觀察到3個或者多個中心體；（2）中心體的直徑為陰性對照的正常膀胱黏膜上皮細胞中心體直徑的2倍及以上，甚至出現(xiàn)巨塊狀中心體；（3）中心體形狀異常，成長條形或線狀。分別轉(zhuǎn)染3次，每轉(zhuǎn)染1次觀察3個玻片，每個玻片觀察150個細胞。在熒光顯微鏡下觀察，計算含異常中心體細胞的百分比；其圖像用Olympus Bx15顯微圖像采集系統(tǒng)采集，中心體平均面積和光密度用Image-pro plus 5.0.21軟件專業(yè)圖像分析軟件（Media Cybernetics誖）分析。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 正常膀胱黏膜上皮和BTCC細胞中心體的觀察

正常膀胱黏膜上皮細胞具有典型的1個或1對中心體（圖1），BTCC細胞中可見到多個巨大或者畸形的中心體（圖2）。

2.2 腺病毒載體轉(zhuǎn)染效率

當腺病毒滴度為1×108IFU/ml時，AdCMV-GFP基因轉(zhuǎn)染的細胞24h后在熒光顯微鏡下觀察幾乎100%的T24細胞核著綠色熒光，表明用腺病毒載體已高效轉(zhuǎn)染（圖3）。

2.2 Wtp53蛋白的表達

對照組T24細胞核著藍色表示陰性，在腺病毒滴度為1×108IFU/ml時，野生型p53基因重組腺病毒載體（Ad-CMVp53）基因轉(zhuǎn)染的細胞經(jīng)免疫細胞化學染色后顯微鏡下觀察有80%以上T24細胞核著棕色或棕黃色，野生型p53基因蛋白表達陽性，說明外源野生型p53基因轉(zhuǎn)染成功（圖4）。

2.3 中心體異常的檢測

正常對照組T24細胞中心體免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)部分T24細胞內(nèi)含有3個、4個、多個，甚至巨型的中心體聚集，平均占總體細胞的百分比為（6.37±1.21）%，中心體平均面積為 130.56±5.57，光密度為6990.22±138.21。而野生型p53基因重組腺病毒載體（Ad-CMVp53）基因轉(zhuǎn)染組細胞出現(xiàn)異常的中心體數(shù)目明顯減少，其平均占總體細胞的百分比為（3.18±1.14）%，中心體平均面積為 73.22±10.28，光密度為4908.67±804.34。轉(zhuǎn)染組和對照組進行比較，野生型p53基因重組腺病毒載體（Ad-CMVp53）基因轉(zhuǎn)染組組異常中心體數(shù)目顯著低于對照組（P<0.01）。見圖 5。

3 討論

中心體是細胞內(nèi)一種微小非膜型細胞器，由一對互相垂直的短筒狀中心粒和中心粒周圍物質(zhì)組成。它的功能是在間期及有絲分裂期的細胞中作為主要的微管組織中心。在有絲分裂過程中它建立兩極紡錘體，紡錘體的微管牽引染色體向兩極運動，從而確保復(fù)制后的染色體分配到兩個子細胞中去，以維持基因組的穩(wěn)定［1］。

中心體結(jié)構(gòu)和功能異常至少有兩個功能性的后果可能在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用：（1）中心體復(fù)制異常形成的多中心體可能導(dǎo)致細胞極性改變、細胞及組織的分化異常；（2）中心體異常導(dǎo)致的有絲分裂紡錘體缺陷可能導(dǎo)致染色體分離錯誤，中心體的過度復(fù)制會形成多極紡錘體，后者使復(fù)制后的兩套染色體分配到兩個以上的子細胞中去。而且多極紡錘體施加在單個染色體上的多方向的力會引起染色體斷裂，中心體復(fù)制或分裂失敗形成單極紡錘體，從而引起染色體不分離。在上述情況下，子細胞都會得到異常數(shù)目的染色體而形成非整倍體，即染色體不穩(wěn)（chromosome instability，CIN）表型。因此中心體的異常與腫瘤基因非整倍體的發(fā)生可能存在直接機制上的聯(lián)系。Yamamoto等［2］對8株膀胱癌細胞株中心體數(shù)目與染色體數(shù)目的關(guān)系研究中發(fā)現(xiàn)，在中心體異常的細胞中其染色體數(shù)目也異常。目前認為染色體基因不穩(wěn)定是人類腫瘤發(fā)生發(fā)展中的中心環(huán)節(jié)，CIN是惡性腫瘤中最常見的基因不穩(wěn)定形式，其中以細胞染色體數(shù)目不成倍數(shù)的增加或減少為表現(xiàn)的非整倍體是CIN最常見的表現(xiàn)形式［3］。

目前調(diào)控中心體功能的因素和導(dǎo)致中心體異常的機制還不清楚。已知的調(diào)節(jié)機制主要涉及以下幾個方面：（1）中心體相關(guān)激酶；（2）泛素—蛋白酶降解途徑相關(guān)物質(zhì)；（3）癌基因和抑癌基因等。野生型p53癌基因作為癌抑制基因，在大多數(shù)腫瘤中都有突變。野生型p53癌基因突變后，可導(dǎo)致腫瘤細胞中心體異常，引起腫瘤細胞CIN，從而促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［3］。許多資料已顯示，p53與膀胱移行細胞癌細胞中心體異常有關(guān)。Kawamura等［4］對20例膀胱移行細胞癌的研究中發(fā)現(xiàn)，在非整倍型DNA體腫瘤中p53異常達78%，而在雙倍體DNA腫瘤中p53異常僅為10%，說明p53異常導(dǎo)致了膀胱腫瘤DNA非整倍性。Kawamura等［5］還對3種膀胱移行細胞癌細胞株的研究中發(fā)現(xiàn)，在含有野生型p53的細胞株（RT-4）中顯示出良好的中心體復(fù)制循環(huán)，而在突變型p53的細胞株（HT-1197和HT-13r）中發(fā)現(xiàn)中心體異常擴增。王連渠等［6］的研究也表明中心體異常與膀胱移行細胞癌的惡性程度有關(guān)。當p53癌基因功能正常時，可以抑制腫瘤細胞中心體的異常，從而抑制癌細胞的生長。Ouyang等［7］研究發(fā)現(xiàn)，將野生型p53導(dǎo)入前列腺癌細胞株，可使細胞株中心體異常發(fā)生減少。本研究也證明，轉(zhuǎn)染野生型p53可抑制膀胱移行細胞癌細胞中中心體異常。目前猜測p53可能是通過轉(zhuǎn)激活—非依賴性和轉(zhuǎn)激活—依賴性機制完成對中心體復(fù)制循環(huán)的調(diào)控。前者可能是通過影響中心體上的激酶Aurora-A完成，后者通過cyclin E-CDK2復(fù)合體使中心體擴增失調(diào)控。Park等［8］研究發(fā)現(xiàn)，在膀胱移行細胞癌癌組織和尿沉渣細胞中均發(fā)現(xiàn)Aurora-A蛋白表達增高。Yamamoto等［2］也發(fā)現(xiàn)膀胱癌細胞株中Aurora-A和p53蛋白均過表達。Kawamura等［9］發(fā)現(xiàn)在人類膀胱腫瘤細胞，cyclin E高表達協(xié)同p53基因突變，導(dǎo)致中心體的擴增和CIN。以前學者認為轉(zhuǎn)染野生型p53癌基因可誘導(dǎo)膀胱癌細胞的凋亡從而抑制癌細胞的生長。根據(jù)本研究結(jié)果，我們認為野生型p53癌基因可能是通過抑制膀胱癌細胞中心體的異常，以減少多極分裂和誘導(dǎo)癌細胞的凋亡共同作用，從而抑制癌細胞的生長。

膀胱腫瘤是泌尿外科的常見腫瘤，且術(shù)后易復(fù)發(fā)，因而目前在臨床上尋找一種切實有效的預(yù)后指標和新的治療方法尤為重要。隨著對中心體研究的逐步深入，在不久的將來，人類可能將探明原癌基因的激活、抑癌基因的失活和細胞周期檢測點失調(diào)節(jié)在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，為臨床上基因治療膀胱腫瘤提供新的理論根據(jù)。中心體亦可能作為惡性腫瘤的化學治療和基因治療的一個新靶點，從而在臨床上為膀胱腫瘤的治療提供一條新途徑。

［1］SchuylerSC，PellmanD.Search，captureandsignal：gamesmicrotubules and centrosomes play［J］.Cell Sci，2001，114（2）：247-255.

［2］Yamamoto Y，Eguchi S，Junpei A，et al.Intercellular centrosome number is correlated with the copy number of chromosomes in bladder cancer［J］.Cancer Genet Cytogenet，2009，191（1）：38-42.

［3］Kramer A，Neben K，Ho AD.Centrosome replication，genomic instability and cancer［J］.Leukemia，2002，16（5）：767-775.

［4］Kawamura K，Ikeda R，Suzuki K.The relationships among ploidy type determined by laser scanning cytometry，the overexpression of p53protein and the numerical aberrations of chromosome 7in bladder cancer［J］.Hinyokika Kiko，2000，46（6）：377-383.

［5］Kawamura K，Moriyama M，Suga K，et al.Centrosome isolation from cultured bladder cancer cells-p53mutation and centrosome hyperamplification［J］.Hinyokika Kiko，2003，49（2）：69-74.

［6］王連渠，王明，譚毅.膀胱癌細胞中心體異常與腫瘤預(yù)后關(guān)系的實驗研究［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志，2008，18（22）：3290-3296.

［7］Ouyang X，Wang X，Xu K，et a1.Effect of p53on centrosome amplification in prostate cancer cells［J］.Biochim Biophys Acta，2001，1543（3）：212-220.

［8］Park HS，Park WS，Bondaruk J，et al.Quantitation of Aurora kinase Agene copy number in urine sediments and bladder cancer detection［J］.JNatl Cancer Inst，2008，100（23）：1740-1740.

［9］Kawamura K，Izumi H，Ma Z，et al.Induction of centrosome amplification and chromosome instability in human bladder cancer cells by p53mutation and cyclin Eoverexpression［J］.Cancer Res，2004，64（14）：4800-4809.

（編輯 陳 姜，英文編輯 王又冬）

Effect of Wild Typep53Gene on Inhibiting the Centrosome Hyperamplification in Bladder Cancer Cell Line

WANGMing，WANGLian-qu，TANYi
（Department of Urology，The First Affiliated Hospital，Chongqing University of Medical Sciences，Chongqing 400016，China）

ObjectiveTo study the effect of wild typep53gene on centrosome hyperamplification in bladder cancer cells.MethodsAwild typep53gene recombinant adenovirus vector AdCMVp53was constructed，and then transfected into the human bladder cancer cell line T24.The cells were stained with the monoclonal antibody against pericentrin by indirect immunofluorescence method.The change of centrosome hyperamplification was observed under the fluorescence microspcope.ResultsIntroduction of wild typep53could suppress the centrosome amplification of T24cell line.Conclusionp53might play an important role in the regulation of centrosome hyperamplification.The loss ofp53might be one of the mechanisms involved in chromosome instability and contribute to the genesis and development of the bladder carcinoma.

wild typep53gene；bladder cancer cell line；centrosome hyperamplification；chromosome instability

R737.14

A

0258-4646（2010）02-0128-04

王明（1963-），男，副教授，碩士.E-mail：wangming1963666@163.com

2009-07-06