蘇 紅， 王新春2，*， 黃志巧， 吳培培

(1.石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆石河子832002;2.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院一附院，新疆石河子832008)

異甘草素(Isoliquiritigenin，ISLG)是甘草黃酮中的一種查爾酮［1］，具有抗腫瘤、抗病毒、抗自由基、抑制脂質(zhì)過氧化等生物活性，能抑制肺癌、乳腺癌、前列腺癌和宮頸癌等多種腫瘤細(xì)胞增殖［2-4］，是一種極具開發(fā)前景的抗腫瘤藥物。因此，鑒于異甘草素較強(qiáng)的藥理活性和藥用價(jià)值，本實(shí)驗(yàn)采用在體循環(huán)灌流法對異甘草素的吸收動(dòng)力學(xué)進(jìn)行考察，以期為異甘草素及含異甘草素的中藥新劑型的研制提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 UV-2401PC型紫外-可見分光光度計(jì)(日本島津);HH-S11-Z型電熱恒溫水浴鍋(北京長安科學(xué)儀器廠);TDL-S臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭儀器廠制造);TG16B型臺(tái)式高速離心機(jī)(中國湖南長沙凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司);T01-100蠕動(dòng)泵驅(qū)動(dòng)器(保定蘭格恒流泵有限公司);電子分析天平(奧豪斯國際貿(mào)易有限公司)。

1.2 試劑及試藥 異甘草素(實(shí)驗(yàn)室自制，HPLC檢測為單一成分，純度為98%);戊巴比妥鈉(上海行知化工廠);人工胃液:按中國藥典2005年版二部附錄XA項(xiàng)下配制:Krebs-Ringe營養(yǎng)液(以下簡稱K-R緩沖液，自配，每1 000 mL含 NaCl 7.8 g，KCl 0.35 g，CaCl20.37 g，NaHCO31.37 g，NaH2PO40.32 g，MgCl20.02 g，葡萄糖1.4 g);空白腸循環(huán)液(K-R緩沖液進(jìn)行大鼠小腸循環(huán)灌注2 h，即得);其余試劑均為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar大鼠，清潔Ⅱ級，體重(250±50)g，♂性，購自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號:新醫(yī)動(dòng)字第2003-0001號。

2 方法

2.1 腸灌流液中藥物濃度的測定

2.1.1 檢測吸收波長的選擇 取異甘草素對照品適量，用K-R緩沖液配制成適宜濃度，以不含藥的K-R緩沖液為空白，在200～800 nm范圍進(jìn)行掃描。結(jié)果，異甘草素在395.5 nm有最大吸收，空白在此波長處無吸收，故選395.5 nm為UV法的檢測波長。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取異甘草素約5.0 mg，精密稱定，置于25 mL量瓶內(nèi)，加無水乙醇溶解并定容至刻度，制得濃度為200 μg/mL的貯備液。精密移取貯備液適量，置于50 mL的量瓶中，用K-R緩沖液定容，制得濃度為10 μg/mL的異甘草素溶液。分別精密移取10.0 μg/mL的異甘草素溶液適量，置于10 mL量瓶中，用K-R緩沖液稀釋并定容至刻度，制得系列濃度的異甘草素溶液。以K-R緩沖液為空白，于395.5 nm處測定吸收度A。以A對異甘草素質(zhì)量濃度C進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=0.117 6C-0.000 6，R=0.999 8。結(jié)果表明，異甘草素溶液濃度在1.0～9.0 μg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.1.3 精密度實(shí)驗(yàn) 分別取濃度為高、中、低3個(gè)濃度的異甘草素對照品溶液，1 d內(nèi)重復(fù)測定3次，計(jì)算日內(nèi)精密度;隔天測定1次，連續(xù)測定3次，計(jì)算日間精密度。結(jié)果日內(nèi)及日間精密度均小于3%。

2.1.4 回收率實(shí)驗(yàn) 精密移取異甘草素對照品貯備液，加入K-R緩沖液液稀釋成含異甘草素對照品溶液3.0、5.0、7.0 μg/mL 的溶液，于395.5 nm 處測定吸收度A，結(jié)果平均回收率為98.65%，RSD為2.11%(n=9)。

2.1.5 異甘草素在空白腸灌流液中的穩(wěn)定性考察用空白腸灌流液配5.0 μg/mL的異甘草素溶液，置于37℃水浴鍋中，并于0、4、6 h測定溶液中異甘草素的含量，根據(jù)藥物的減少量來考察其穩(wěn)定性。結(jié)果，異甘草素含量在6h內(nèi)未發(fā)生明顯變化，表明異甘草素在實(shí)驗(yàn)過程中具有較好的穩(wěn)定性。

2.2 大鼠在體腸灌流實(shí)驗(yàn)

2.2.1 大鼠腸灌流實(shí)驗(yàn)方法［5-6］為消除實(shí)驗(yàn)過程中管路對藥物的吸附作用，于實(shí)驗(yàn)開始前取供試液反復(fù)沖洗實(shí)驗(yàn)管道，直至出液口藥液濃度與供試液濃度相等。取禁食12 h(可自由飲水)的大鼠，稱重，腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉，于恒溫手術(shù)臺(tái)上固定并保持體溫。沿腹中線切開腹腔，選擇實(shí)驗(yàn)?zāi)c段，緩緩注入37℃生理鹽水將腸道內(nèi)容物沖凈，上端插管，手術(shù)線結(jié)扎固定，再將傷口用浸有生理鹽水的脫脂棉覆蓋保濕。將腸段兩端的插管與蠕動(dòng)泵膠管連接形成回路。取37℃供試液以0.5 mL/min的流速泵入腸段，使腸段內(nèi)充滿供試液，再將流速調(diào)至0.25 mL/min恒速灌流，約0.5 h。進(jìn)口處用已知質(zhì)量的裝有供試液的小瓶進(jìn)行灌流，出口處用已知質(zhì)量小瓶每隔15 min分段收集流出液，共收集5次流出液，每收集一次迅速精確稱定供試液小瓶和收集液小瓶質(zhì)量。收集結(jié)束后，剪下所灌流的腸段，測量其長度(l)和內(nèi)徑(r)。取樣品置于1.5 mL離心管中，以 3 000 r/min的速度離心15 min后，用紫外分光光度法測定異甘草素的濃度。

2.2.2 數(shù)據(jù)處理 小腸不僅吸收藥物，也吸收和分泌水份，導(dǎo)致灌流液體積變化，因此，不能用直接測定藥物濃度的方法計(jì)算藥物的吸收。本實(shí)驗(yàn)采用重量分析法對灌流液的流入和流出的體積進(jìn)行校正，消除其體積變化的影響。按下式計(jì)算藥物吸收速率常數(shù)(Ka)和藥物表觀吸收系數(shù)(Papp):

式中Qin和Qout分別為灌入和收集的供試液體積(mL);Cin和Cout分別為進(jìn)口和出口處緩沖液中的藥物質(zhì)量濃度(μg/mL);l和r分別為被考察腸段長度(cm)和內(nèi)徑(cm);Q為灌流速度(0.25 mL/min);V為被考察腸段的體積;Ka和Papp為最后5個(gè)時(shí)間段(45～105 min)樣品的平均值。

3 結(jié)果

3.1 大鼠腸道各區(qū)段吸收情況考察 以濃度為5.0 μg/mL異甘草素供試液對大鼠十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸組各區(qū)段吸收特性進(jìn)行考察，灌流速度0.25 μg/mL。按2.2.1項(xiàng)的方法操作，計(jì)算不同腸段的Ka值和Papp值，進(jìn)行比較。結(jié)果見表1。

表1 異甘草素在大鼠不同腸段的Ka和Papp值(± s，n=5)

表1 異甘草素在大鼠不同腸段的Ka和Papp值(± s，n=5)

腸段 Papp×10-2/(cm/min) Ka×10-1/min十二指腸1.068 1±0.154 7 0.847 2±0.258 1空腸 1.145 3±0.043 2 0.932 2±0.034 2回腸 1.111 4±0.390 6 0.865 2±0.142 3結(jié)腸1.560 6±0.272 1 1.305 1±0.119 6

3.2 不同藥物濃度異甘草素的腸吸收考察 分別采用1.0、5.0、9.0 μg/mL異甘草素供試液進(jìn)行空腸段灌流，灌流速度0.25 μg/mL，按2.2.1項(xiàng)的方法操作，考察藥物的質(zhì)量濃度對腸吸收的影響。結(jié)果見表2。

表2 異甘草素不同濃度的Ka和Papp值 (±s，n=5)

表2 異甘草素不同濃度的Ka和Papp值 (±s，n=5)

C(μg/mL) Papp/×10-2/(cm·min) Ka/×10-1/min 1 1.263 1±0.064 9 0.916 4±0.192 1 5 1.022 5±0.108 6 1.015 2±0.156 6 9 1.198 6±0.054 6 0.931 5±0.024 5

4 討論

在吸收面積不變時(shí)，在1～9 μg/mL內(nèi)，隨著濃度增加，異甘草素溶液在大鼠小腸的Ka和Papp無顯著性差異，符合Fick＇s擴(kuò)散定律，表明異甘草素主要以被動(dòng)擴(kuò)散的方式吸收，所以初步確定吸收機(jī)制為被動(dòng)擴(kuò)散。

中藥有效成分口服吸收特性是中藥新制劑新劑型設(shè)計(jì)處方前研究的重要內(nèi)容，是提高中藥口服給藥生物利用度的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，異甘草素在整個(gè)腸段均有吸收，在各腸段的Ka、Papp是結(jié)腸＞空腸＞回腸＞十二指腸，且結(jié)腸的Ka、Papp值與其他腸段存在顯著性差異(P＜0.05)。因此，研究結(jié)果為異甘草素緩釋給藥系統(tǒng)或結(jié)腸定位給藥制劑的研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對異甘草素口服新制劑的研究具有一定的指導(dǎo)意義。

［1］刑國秀，李 楠，王 童，等.甘草中黃酮類化學(xué)成分的研究進(jìn)展［J］.中國中藥雜志，2003，28(7):593-595.

［2］Kanazawa M，Satomi Y，Mizutani Y，et al.Isoliquiritigenin inhibits the growth of prostate cancer［J］.Eur Urol，2003，43(5):580-586.

［3］Hsu Y L，Kuo P L，Chiang L C，et al.Isoliquiritigenin inhibits the proliferation and induces the apoptosis of human non-small cell lung cancer A549 cells［J］.Clin Exp Pharmacol Physiol，2004，31(7):414-418.

［4］張 晶，楊 靜，湯宏斌.異甘草素對人宮頸癌細(xì)胞增殖的抑制作用［J］.中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2005，19(6):436-442.

［5］黃懷鵬，劉 霞.積雪草苷大鼠在體腸吸收動(dòng)力學(xué)研究［J］.中草藥，2008，39(7):1056-1058.

［6］吳雅娜，立 標(biāo).獨(dú)活有效成分大鼠在體單向灌流腸吸收［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2008，43(1):102-107.