趙小華 吳桂英 寇賀紅 鄭彥麗 趙桂廷

利用酶解法測定復(fù)合維生素溶液中維生素A含量的研究

趙小華 吳桂英 寇賀紅 鄭彥麗 趙桂廷

建立堿性蛋白酶-高效液相色譜法測定復(fù)合維生素溶液中維生素A的含量。利用堿性蛋白酶的方法處理樣品，并采用 EcoSic HPLC Coumw-ODS，C18 柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）分離,檢測波長為326 nm，流動相為甲醇+水（95+5）等高效液相色譜條件檢測樣品中維生素A的含量。結(jié)果顯示，樣品中維生素A與其他組分分離良好，維生素A濃度在120～600 IU/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.999 7）,平均回收率在99.9%（n=5）,RSD為1.0%。本方法簡便、快捷，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性好，可作為企業(yè)控制生產(chǎn)過程中復(fù)合維生素溶液質(zhì)量的方法之一。

堿性蛋白酶；高效液相色譜法；復(fù)合維生素溶液；維生素A

維生素A（Vitamin A）又稱視黃醇，是1913年美國化學(xué)家臺維斯從鱈魚肝中提取得到一種不溶于水，易溶于脂肪、油等有機溶劑的黃色粉末。其主要生理功能包括：維持視覺、促進生長發(fā)育、維持上皮結(jié)構(gòu)的完整與健全、加強免疫能力、清除自由基等。因此常作為補充動物營養(yǎng)、提高生產(chǎn)性能的維生素之一。1999年國家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局頒布的國家標(biāo)準(zhǔn)——飼料中維生素A的測定適用于復(fù)合維生素預(yù)混料中維生素A的測定。由于飼料中成分復(fù)雜，樣品前處理需要經(jīng)過一系列的皂化、提取、濃縮等方法處理，最后采用高效液相色譜法測定維生素A含量雖然很好，但是由于復(fù)合維生素預(yù)混料成分相對簡單，再利用該法控制質(zhì)量，其操作過程不僅費時費力，而且檢測結(jié)果的精確性還與檢測人員實驗技能操作熟練程度有關(guān)。因此國內(nèi)飼料添加劑企業(yè)想通過尋找一種簡便、快捷、可靠的方法測定復(fù)合維生素預(yù)混料中維生素A的含量。

1 儀器與試劑

1.1 儀器與色譜條件

高效液相色譜儀:Agilent Technologies 1200series；色譜條件：色譜柱EcoSic HPLC Coumw-ODS、C18柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）、檢測波長 326 nm、流動相為甲醇+水（95+5）、流速為 2.0 ml/l、進樣量為 10 μl、柱溫35℃；萬分之一分析天平：Sartorius Bs224s。

1.2 試劑

對照品為維生素A乙酸酯：批號K0210906,100萬IU/ml，中國獸藥監(jiān)察所；堿性蛋白酶：批號090926，10萬IU/g，浙江海寧金潮實業(yè)有限公司；復(fù)合維生素溶液（主要成分為VA、VD、VE，標(biāo)示量分別為 12 000、8 000、8 IU/ml）：批號 091030、091108、091125，佛山市南海東方澳龍制藥有限公司生產(chǎn)；空白樣品（不含主要成分的復(fù)合維生素溶液，自制）；10%氨水溶液（自制）；純化水（自制）；無水乙醇（分析純）；甲醇（色譜純）。

2 方法和結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取對照品（維生素A乙酸酯）60 mg置100 ml的棕色容量瓶中，精密量取10 ml的10%氨水溶液置棕色容量瓶中，再加50 ml的無水乙醇，超聲使其溶解，再精密稱取堿性蛋白酶1 g加入到棕色容量瓶中，振搖，用無水乙醇稀釋至刻度后在超聲10 min,先用濾紙過濾，再用微孔濾膜（0.45 μm）過濾，取過濾液即得，圖1為對照品的HPLC圖譜。

2.2 供試品溶液的制備

精密量取復(fù)合維生素溶液5 ml到100 ml棕色容量瓶中，精密量取10 ml的10%氨水溶液置棕色容量瓶中，再加50 ml的無水乙醇，超聲使其溶解，再精密稱定堿性蛋白酶1 g加入到棕色容量瓶中，振搖，用無水乙醇稀釋至刻度后在超聲10 min,先用濾紙過濾，再用微孔濾膜（0.45 μm）過濾，取過濾液即得供試品溶液，圖2為供試品的HPLC圖譜。

2.3 空白實驗

精密量取空白樣品5 ml，分別按照2.2項方法處理樣品，結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示空白樣品對該系統(tǒng)沒有干擾。

2.4 線性關(guān)系考察

精密稱取 2.1 節(jié)對照品溶液 1、2、3、4、5 μl分別注入液相色譜儀，以色譜峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進樣量（μl，X）為橫坐標(biāo)繪制維生素A乙酸酯標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得出回歸方程Y=230.2X+48.4（R=0.999 7），維生素A乙酸酯在120～600 IU/ml的范圍呈良好線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4。

圖1 對照品維生素A乙酸酯的HPLC圖譜

圖2 復(fù)合維生素溶液中維生素A的HPLC圖譜

圖3 空白樣品的HPLC圖譜

圖4 對照品維生素A乙酸酯標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 精密度實驗

精密吸取對照品溶液10 μl，連續(xù)進樣5次測定其峰面積，根據(jù)連續(xù)進樣5次測定的峰面積，計算出RSD=0.40%。

2.6 穩(wěn)定性實驗

取同一批號供試品溶液按1.1節(jié)色譜條件0、10、20、30、50 min、1 h、2 h 進樣，分別測定其峰面積（見表1）。經(jīng)過在不同時間點測定樣品的峰面積值，結(jié)果表明，樣品在2 h內(nèi)無明顯的變化,說明實驗過程中樣品的穩(wěn)定性良好。

表1 供試品穩(wěn)定性實驗結(jié)果

2.7 重現(xiàn)性考察

精密量取同一批號供試品5 ml共6份，按照2.2項下制備供試品溶液，和1.1項下色譜條件測定維生素A的含量，結(jié)果見表2。

表2 供試品重現(xiàn)性考察結(jié)果

通過連續(xù)6次測定樣品的峰面積值，利用對照品比值法計算出的結(jié)果表明重現(xiàn)性良好。

2.8 回收率實驗

精密量取復(fù)合維生素溶液5 ml，添加已知準(zhǔn)確含量的維生素A乙酸酯原料0.06 g（精確至0.000 2 g），測定其回收率，結(jié)果見表3。

表3 維生素A乙酸酯回收率實驗結(jié)果

由表3可知，樣品的平均回收率為99.9%（RSD=1.0%），說明通過酶解法測定復(fù)合維生素溶液中維生素A具有良好的回收率。

2.9 樣品含量測定

分別精密量取3個批號的供試品各5 ml和對照品（維生素A乙酸酯）60 mg，分別按照2.2節(jié)和2.1節(jié)方法制備供試品溶液和對照品溶液，并按照1.1節(jié)色譜條件檢測維生素A的含量，結(jié)果見表4。

表4 3批供試品中維生素A含量的測定結(jié)果

3 討論

3.1 測定方法的選擇

復(fù)合維生素預(yù)混料的傳統(tǒng)檢測方法樣品前處理需要經(jīng)過一系列的皂化、提取、濃縮等方法處理，最后采用高效液相色譜法測定維生素A含量雖方法很好，但其操作過程不僅費時、費力，而且檢測結(jié)果的精確性還與檢測人員實驗技能操作熟練程度有關(guān)。參考郭芙蓉等（2006）和蔣一昕（2003、2005）的研究方法和維生素A乙酸酯微粒的檢測方法，并經(jīng)過長期不斷的實踐，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用堿性蛋白酶酶解處理復(fù)合維生素預(yù)混料后，采用高效液相色譜法測定維生素A含量不僅簡便快捷，而且結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

3.2 樣品處理

在實驗過程中，所有樣品前處理首先用10%氨水溶液與50 ml的無水乙醇溶解，并且一定要等待樣品完全溶解后再加堿性蛋白酶，如果過早加入堿性蛋白酶，會使得堿性蛋白酶與樣品包粘在一起，而導(dǎo)致酶解不完全。

3.3 堿性蛋白酶

樣品處理過程中堿性蛋白酶的添加量與取樣量中維生素A的含量有一定的關(guān)系，即堿性蛋白酶的添加量（萬IU）與取樣量中維生素A的標(biāo)示量（萬IU）比值不得少于10/6。如果取樣量中維生素A的標(biāo)示量異常高時，堿性蛋白酶的添加量應(yīng)為常規(guī)添加量的兩倍以上，這樣才能保證堿性蛋白酶使樣品完全酶解。

3.4 波長的選擇

根據(jù)HPLC掃描的三維立體色譜圖（波長在200～500 nm）顯示維生素A有吸收，結(jié)合等吸收圖和圖1、圖2綜合考慮，確定在326 nm處作為復(fù)合維生素溶液的檢測波長。

4 小結(jié)

使用堿性蛋白酶-高效液相色譜法測定復(fù)合維生素溶液中維生素A乙酸酯含量的方法簡便、快捷、結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性好，故能夠更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，并為飼料添加劑企業(yè)提供復(fù)合維生素預(yù)混料內(nèi)部控制質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)作參考。

[1] 曹威榮，張春善.淺談維生素A在家禽體內(nèi)的代謝及營養(yǎng)作用[J].飼料博覽，2006（4）：45-48.

[2] 郭芙蓉,杜紅鴿.酶解法測定飼料中維生素A、E的含量[J].河南畜牧獸醫(yī),2006（1）:8.

[3] 蔣一昕.酶解法測定飼料中維生素A含量[J].獸藥與飼料添加劑,2003（6）:26-27.

[4]蔣一昕.反相高效液相色譜法測定預(yù)混合飼料中維生素A乙酸酯的含量[J].中國獸藥雜志,2005,39（2）:14-18.

S816.17

趙小華，佛山市南海東方澳龍制藥有限公司，528234，廣東省佛山市南海松崗松夏工業(yè)園科技西路。

吳桂英、寇賀紅（通訊作者）、鄭彥麗、趙桂廷，單位及通訊地址同第一作者。

2010-02-01

（編輯：高 雁，snowyan78@tom.com）