雷 萍 黃志英

目前市場銷售的飼料酸化劑甲酸、丙酸產(chǎn)品品種繁多，但飼料酸化劑甲酸、丙酸的分析檢測方面的研究尚未見報道，酸化劑中甲酸、丙酸含量無法準(zhǔn)確知曉。這必然影響飼料酸化劑生產(chǎn)的質(zhì)量控制以及相關(guān)學(xué)科研究工作的開展。高效液相色譜分析法是目前食品加工工業(yè)中有機(jī)酸分析的常用方法，其特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高，可用于多種有機(jī)酸的同時分離檢測。為此，本文在總結(jié)食品中有機(jī)酸液相色譜分析相關(guān)資料的基礎(chǔ)上，通過對飼料有機(jī)酸化劑中甲酸、丙酸的反相液相色譜定量分析，探討飼料酸化劑中有機(jī)酸的分析檢測方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器

WATERS 2695高效液相檢測系統(tǒng)：WATERS 2487 TUV Detector，恒溫超聲波儀（0～60 ℃）。

1.2 試劑

甲酸、丙酸購自Sigma公司（St.Louis,MO,USA）。磷酸、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，各種樣品均按說明使用。兩種標(biāo)準(zhǔn)儲備液濃度均為2000 μg/ml，用去離子水配制，避光4℃低溫保存。其它不同濃度的工作液，用去離子水稀釋得到。

試液與運(yùn)行緩沖液均經(jīng)0.22 μm聚丙烯濾膜過濾后再使用。

1.3 樣品處理

稱取飼料酸化劑約0.3 g(精確至0.0001 g)，置于磨口平底燒瓶中，加人80.0 ml純凈水超聲30 min，然后轉(zhuǎn)移到100 ml容量瓶中，用純凈水稀釋至刻度，然后用0.45 μm聚丙烯濾膜過濾。

1.4 液相色譜條件

色譜柱：CAPCELL PAK C185 μm，4.6×250 mm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：20 μl；流動相：A(乙腈)： 緩沖液B（0.404 g庚烷磺酸鈉用純水溶解后，加入0.2 ml磷酸，定容至 1 L）=10： 90；流速：0.7 ml/min；波長：210 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 試樣提取條件的選擇

超聲波提?。簻?zhǔn)確稱取已粉碎混勻的樣品0.3 g(精確至00001 g)，加入純凈水80 ml，于超聲波清洗器中分別提取 5、10、15、20、25、30 min，定容后經(jīng) 0.45 μm聚丙烯濾膜過濾后直接進(jìn)樣。

試驗(yàn)表明：隨著超聲提取時間的延長，提取的效率有增加的趨勢；提取時間為25和30 min的提取效率基本相同。為保證樣品中的甲酸和丙酸能充分溶解，選擇超聲時間30 min。

2.2 緩沖液酸度與濃度

由于有機(jī)酸均為弱酸，易在水系流動相中發(fā)生解離而不被非極性鍵合相保留，通常采用酸性磷酸氫鹽溶液抑制解離，改善有機(jī)酸的保留和分離。文獻(xiàn)中大多選擇磷酸氫鹽溶液作為流動相。

研究表明：磷酸鹽緩沖液濃度的高低影響酸存在形式的穩(wěn)定性，從而影響分離效果。隨著磷酸鹽濃度的增加，分離效果和出峰時間受濃度的影響較小，在低濃度時也能獲得好的分離效果。但當(dāng)樣品中含有雜質(zhì)，當(dāng)濃度較低時由于緩沖能力較小，會形成負(fù)峰，而高濃度的磷酸鹽緩沖液會對柱子和泵產(chǎn)生一定的影響。

所以實(shí)驗(yàn)中選擇在0.02%的磷酸溶液中添加少量的離子對試劑來改善甲酸和丙酸在色譜柱上的保留，既能達(dá)到較好的分離效果，又能減少對柱子和泵的損傷。

甲酸和丙酸的標(biāo)樣色譜如圖1所示。

2.3 重現(xiàn)性、線性范圍

在上述優(yōu)化條件下，將濃度均為500 μg/ml的D-甲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和丙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣7次，實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性良好。峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)按出峰次序分別為1.6%和1.9%。

圖1 甲酸、丙酸標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜

配制一系列不同濃度的甲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（150～1400 μg/ml）和丙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(150～700 μg/ml)，在上述優(yōu)化條件下測得峰面積，以峰面積對濃度作圖，得到甲酸和丙酸的工作曲線，結(jié)果見表1。

表1 線性回歸方程和線性范圍

2.4 樣品測定

在同一色譜分離條件下，對飼料有機(jī)酸化劑中的甲酸、丙酸進(jìn)行了分離檢測，其色譜圖見圖2，定量結(jié)果見表2。

圖2 飼料有機(jī)酸化劑中甲酸、丙酸色譜

表2 飼料有機(jī)酸化劑甲酸、丙酸含量的分析結(jié)果（%）（n=5）

從色譜圖(見圖2)可以看出，甲酸和丙酸兩種有機(jī)酸化劑的組成存在明顯差異，但均含有甲酸和丙酸，且這兩種有機(jī)酸色譜峰均達(dá)到較好的分離度，保留時間與相應(yīng)有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)基本一致。說明液相色譜可用于酸化劑中甲酸和丙酸成分分析。由表2可知，兩種酸化劑中甲酸和丙酸含量明顯不同，但變異系數(shù)變化程度基本一致，變異系數(shù)不超過3%，表明該方法具有較好的精密度。

2.5 回收率實(shí)驗(yàn)

取已知甲酸、丙酸含量的有機(jī)酸化劑各0.3 g(準(zhǔn)確至 0.0001 g)，分別加入 10 ml 2000 μg/ml甲酸、丙酸標(biāo)準(zhǔn)貯備液，按1.3節(jié)所述樣品前處理方法制備提取液，并進(jìn)行液相色譜分析。依添加前后分析值的差值與實(shí)際添加量的百分比分別計算甲酸、丙酸的回收率。每種有機(jī)酸化劑中甲酸和丙酸的回收率平行測定3次?；厥章式Y(jié)果表明，酸化劑中甲酸的回收率為98%～101%，丙酸的回收率為97%～99%，該方法表現(xiàn)出較高的準(zhǔn)確性。

3 小結(jié)

采用高效液相色譜法可同時檢測分析飼料有機(jī)酸化劑中甲酸和丙酸的化學(xué)含量，具有快速、簡便、能使各組分較好的分離等特點(diǎn)，并表現(xiàn)出較高的準(zhǔn)確性和精確度，其測試成本低，有一定的推廣價值。

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