周林艷 萬(wàn)美珍 袁 焱 岳靈萍

實(shí)體腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移與缺氧密切相關(guān)，并且缺氧限制了非手術(shù)治療的成功率，使腫瘤細(xì)胞更能耐受化療、放療等治療手段[1]。碳酸酐酶CAIX是近來(lái)發(fā)現(xiàn)的1個(gè)重要的檢測(cè)細(xì)胞缺氧的指標(biāo)。越來(lái)越多的資料顯示其表達(dá)升高與腫瘤的發(fā)展和預(yù)后相關(guān),是腫瘤相關(guān)基因[2]。我們對(duì)84例胃癌組織中HIF-1α和CAIX的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，并分析與其臨床病理特征的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究資料

收集1998年～2005年我院手術(shù)切除的胃癌組織標(biāo)本84例，經(jīng)10%甲醛固定后常規(guī)石蠟包埋3 μm厚連續(xù)切片。84例胃癌組織按組織學(xué)分級(jí)，未或低分化型25例，中或高分化型59例。按浸潤(rùn)深度分級(jí)，浸潤(rùn)至黏膜或黏膜下24例，浸潤(rùn)至肌層或漿膜下37例，穿透漿膜層23例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移43例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移41例。腫瘤直徑≤5 cm有34例，>5 cm有50例。其中男性46例，女性38例。年齡39～82歲，<60歲44例，≥60歲40例。

1.2 主要試劑

鼠抗人HIF-1α、CAIX單克隆抗體及其它相關(guān)試劑購(gòu)于福州邁新公司。

1.3 檢測(cè)方法

采用免疫組織化學(xué)SP法。石蠟包埋的組織4μm連續(xù)切片；二甲苯脫蠟，乙醇梯度水化；3%過(guò)氧化物消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；EDTA修復(fù)；正常羊血清室溫下封閉；加入既用型一抗(鼠抗人HIF-1α單抗，鼠抗人CAIX單抗)4℃冰箱過(guò)夜；PBS清洗，加入二抗,DAB顯色，蘇木精對(duì)比染色，中性樹(shù)膠封片。

1.4 結(jié)果判斷

由病理科專(zhuān)科醫(yī)生獨(dú)立閱片，對(duì)照HE染色確定腫瘤細(xì)胞區(qū)域，于顯微鏡下觀(guān)察，HIF-1α表達(dá)結(jié)果按照腫瘤細(xì)胞的染色比例分級(jí)。以伴或不伴胞質(zhì)染色的細(xì)胞核染色為陽(yáng)性計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)[3]。未著色為(-)；核染色<1% (+)；核染色1%～10%伴或不伴胞質(zhì)弱染色(++)；核染色 11%～50%伴或不伴明顯的胞質(zhì)染色(+++)；核染色 >50% 伴或不伴強(qiáng)烈的胞質(zhì)染色(++++)；前3個(gè)等級(jí)為陰性表達(dá)，后兩個(gè)等級(jí)為陽(yáng)性表達(dá)。CAIX陽(yáng)性定位于細(xì)胞膜，陽(yáng)性表達(dá)根據(jù)表達(dá)的細(xì)胞數(shù)(0～100%)和表達(dá)強(qiáng)度(無(wú)表達(dá)為0，弱表達(dá)為1，中等表達(dá)為2，強(qiáng)表達(dá)為3)來(lái)計(jì)算的，兩者相乘范圍為0～300，≥150為陽(yáng)性表達(dá)[4]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SAS8.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)行配對(duì)χ2檢驗(yàn)及Fishers確切檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織與癌旁組織中CAIX表達(dá)情況

84例胃癌組織中，CAIX陽(yáng)性表達(dá)率為76.2%(64/84)。癌旁?xún)?nèi)正常胃組織中其陽(yáng)性表達(dá)率為26.0%(22/84)。癌組織中CAIX陽(yáng)性率顯著高于癌旁組織(P<0.05)。

2.2 CAIX表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系(表1)

有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組織中CAIX陽(yáng)性率明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組織(P<0.05)；浸潤(rùn)至肌層或漿膜下、穿透漿膜層癌組織中CAIX陽(yáng)性率明顯高于浸潤(rùn)至黏膜或黏膜下癌組織(P<0.05)，穿透漿膜層癌組織中CAIX陽(yáng)性率明顯高于浸潤(rùn)至肌層或漿膜下癌組織(P<0.05)；未或低分化與中或高分化癌組織中CAIX陽(yáng)性率比較無(wú)差異(P>0.05)；腫瘤直徑≤5 cm與>5 cm癌組織中CAIX陽(yáng)性率比較有差異(P<0.05)；男性與女性患者CAIX陽(yáng)性率比較無(wú)差異(P>0.05)；<60歲與≥60歲患者CAIX陽(yáng)性率比較無(wú)明顯差異(P>0.05)。

2.3 HIF-1α表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中HIF-1α陽(yáng)性率明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組織(P<0.05)；浸潤(rùn)至肌層或漿膜下、穿透漿膜層癌組織中HIF-1α陽(yáng)性率明顯高于浸潤(rùn)至黏膜或黏膜下癌組織(P<0.05)，穿透漿膜層癌組織中HIF-1α陽(yáng)性率明顯高于浸潤(rùn)至肌層或漿膜下癌組織(P<0.05)；未或低分化與中或高分化癌組織HIF-1α陽(yáng)性率比較無(wú)差異(P>0.05)；腫瘤直徑≤5 cm與>5 cm癌組織中HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)率比較無(wú)差異(P>0.05)；男性與女性患者HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)率比較無(wú)差異(P>0.05)；<60歲與≥60歲患者HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)率比較無(wú)明顯差異(P>0.05),見(jiàn)表1。

2.4 HIF-1α表達(dá)與CAIX表達(dá)的相關(guān)性

HIF-1α表達(dá)與CAIX表達(dá)有明顯相關(guān)性，P<0.05，見(jiàn)表2。

3 討論

CAIX是具有高活性碳酸酐酶，最早發(fā)現(xiàn)是在與人乳腺癌細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)的人宮頸癌的Hela細(xì)胞系中，并認(rèn)為是具有腫瘤相關(guān)基因產(chǎn)物的特點(diǎn)。它是由酸性氨基酸組成的跨膜蛋白。分布于細(xì)胞膜和細(xì)胞核。近來(lái)發(fā)現(xiàn)CAIX是缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1的1個(gè)新的靶基因，這對(duì)于認(rèn)識(shí)腫瘤組織微環(huán)境缺氧所引起的一系列變化及評(píng)價(jià)CAIX在腫瘤的診斷與治療中的作用具有很大意義。

CAIX蛋白在正常人上消化道中有表達(dá)，通常定位于有高增殖能力的上皮細(xì)胞中，提示它具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的作用[5]。我們的研究中，癌旁組織中CAIX的表達(dá)為26%，主要定位于胃小凹上皮細(xì)胞基底側(cè)質(zhì)膜面，這類(lèi)細(xì)胞具有較強(qiáng)的增生能力。近來(lái)有研究[6]顯示，活體腫瘤細(xì)胞中的碳酸酐酶可以使瘤細(xì)胞外PH下降，從而使胞內(nèi)PH保持穩(wěn)定，因此細(xì)胞能耐受缺氧。此外PH降低有利于腫瘤外基質(zhì)降解，有助于腫瘤細(xì)胞的遷徒和轉(zhuǎn)移。在我們研究中，通過(guò)對(duì)84例胃癌組織的檢測(cè)，CAIX在胃癌組織中的表達(dá)率為64%，并與腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移有關(guān)，腫瘤浸潤(rùn)程度越深、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤組織越大，CAIX陽(yáng)性率越高。同樣結(jié)果在結(jié)腸癌研究中也有提示。這一結(jié)果提示CAIX表達(dá)陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞更具有生長(zhǎng)、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的優(yōu)勢(shì)。Chen等[7]也發(fā)現(xiàn)CAIX的表達(dá)與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。從而我們可以通過(guò)評(píng)估CAIX表達(dá)來(lái)預(yù)測(cè)胃癌的預(yù)后情況，并通過(guò)靶向治療抑制其表達(dá)從而抑制其侵襲生長(zhǎng)的能力。CAIX表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系也見(jiàn)于許多其他惡性腫瘤中。Hussain等[8]研究也提示CAIX表達(dá)與乳腺癌的不良預(yù)后相關(guān)。Kon-no等[9]發(fā)現(xiàn)CAIX表達(dá)與腫瘤進(jìn)展相關(guān)，提示CAIX表達(dá)的肺腺癌的預(yù)后不好，另外許多學(xué)者在肺癌、腦膠質(zhì)細(xì)胞癌、宮頸癌等腫瘤中也發(fā)現(xiàn)CAIX表達(dá)與其不良預(yù)后及其進(jìn)展相關(guān)。 實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)CAIX的表達(dá)與腫瘤大小有明顯相關(guān)性，這可能與缺氧引起腫瘤中血管生成，支持腫瘤的生長(zhǎng)有關(guān)，但這需要更多實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)。

表1 HIF-1α和CAIX表達(dá)與胃癌臨床病理因素的關(guān)系(例，%)

表2 HIF-1α表達(dá)與CAIX表達(dá)的關(guān)系

另外，我們發(fā)現(xiàn)胃癌組織中CAIX表達(dá)與HIF-表達(dá)具有明顯相關(guān)性?，F(xiàn)在研究認(rèn)為CAIX是HIF-1α的靶基因，受HIF-1α表達(dá)的調(diào)控。在我們的實(shí)驗(yàn)中，CAIX監(jiān)測(cè)腫瘤細(xì)胞的缺氧程度，正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的表達(dá)存在顯著差異，即在正常生長(zhǎng)狀態(tài)下，CAIX的表達(dá)并不發(fā)揮其影響細(xì)胞侵襲力的功能，而在缺氧環(huán)境下，CAIX表達(dá)增加，通過(guò)與其它一系列蛋白包括HIF-1α的相互作用，才發(fā)揮其功能，進(jìn)一步說(shuō)明在胃癌組織中，缺氧引起HIF-1α及其下游基因CAIX、VEGF的表達(dá)增加，從而共同參與胃癌的進(jìn)展。但Driessen等[10]則認(rèn)為CAIX是可以作為胃癌預(yù)后的獨(dú)立判斷指標(biāo)的。

因此，CAIX是胃癌缺氧、侵襲和轉(zhuǎn)移的重要標(biāo)志，是重要的預(yù)后指標(biāo)。同時(shí)CAIX表達(dá)陽(yáng)性對(duì)于選擇缺氧治療和生物還原物治療有指導(dǎo)意義，為腫瘤治療提供新思路，應(yīng)用其抑制劑抑制其侵襲力，并增強(qiáng)化療藥的療效。

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