廖林虹 于曉紅

腫瘤細胞逃逸機體的免疫監(jiān)視與腫瘤細胞高表達B7分子有關(guān)，B7-H4是協(xié)同刺激因子B7家族中的1個新成員，B7-H4-Ig融合蛋白或與B7-H4分子相關(guān)的細胞參與抑制T細胞介導的抗體特異性免疫應答的調(diào)節(jié)[1]。RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，B7-H4 mRNA在脾、肺、胸腺、胎盤、肝、骨胳肌、腎、胰、前列腺、睪丸、卵巢和小腸中均表達；B7-H4蛋白在體外活化的T細胞、B細胞、單核細胞和樹突狀細胞中表達，而在正常組織中不表達[2]；B7-H4在許多腫瘤組織中有表達，如卵巢癌、布倫納瘤、乳腺癌、前列腺癌和食管癌等[3～6]，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預后相關(guān)。Simon等[7]發(fā)現(xiàn)可溶性B7-H4高度特異性表達在漿液性卵巢癌血清，為卵巢癌早期診斷、指導治療腫瘤提供了新的生物標記物和依據(jù)。本研究應用RT-PCR及免疫組織化學PV-9000二步法，研究分析B7-H4基因在40例卵巢漿液性癌中的表達，分析卵巢漿液性癌B7-H4蛋白的表達情況與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料 選取江西省婦幼保健院2005年4月～ 2009年12月收治的40例卵巢漿液性癌為患者研究對象，年齡32～67歲(48.8±7.41)歲，術(shù)前均未接受任何治療；FIGO分期(2006年標準)：Ⅰ期8例，Ⅱ期5例，Ⅲ期17例，Ⅳ期10例；組織病理學分級：高分化3例，中分化13例，低分化24例。對照組為同期20例交界性卵巢漿液性腫瘤和15例卵巢漿液性囊腺瘤組織。

1.1.2 試劑 PCR引物由北京三博遠志公司合成，免抗B7-H4多克隆抗體購自Santa Cruz，二抗試劑盒、DAB顯色液系北京中杉金橋產(chǎn)品，PT-PCR試劑盒系北京鼎盛公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 B7-H4 mRNA表達的檢測 采用RT-PCR技術(shù)，0.1%DEPC處理所有的實驗用品，從液氮中取出收集的卵巢漿液性腫瘤組織研磨，按照說明操作，用Trizol試劑在凈化操作臺內(nèi)抽提總RNA，紫外分光光度儀檢測A260/A280，測定其質(zhì)量和濃度，A260/A280在1.8～2.0之間；行RT-PCR擴增，以β-肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參照物。B7-H4序列[8](184 bp)：上游，5’CCCAATCCGAAGTGTCAACT3’；下游，5’TATCCTGGTGCCCGATAGAG3’。β-actin引物序列(285bp)：上游，5’AGCGAGCATCCCCCAAAGTT3’；下游，5’ GGGCACGAAGGCTCATCATT3’。95℃變性5 min，PCR擴增條件為95℃45 s，58℃45 s，72℃45 s，35個循環(huán)，72℃延伸7 min，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外觀測儀下觀察攝像。

1.2.2 B7-H4蛋白表達的檢測 采用免疫組化PV-

9000二步法。石蠟標本切片厚4 μm，二甲苯、酒精脫蠟，微波加熱抗原修復，滴加3%雙氧水20 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，依次滴加兔抗一抗(1∶100稀釋)37℃或室溫孵育20 min，增強劑37℃或室溫孵育20 min，鼠/兔抗人二抗37℃或室溫孵育30 min，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色1～5 min，蘇木精復染，磷酸鹽緩沖液(PBS)返藍，梯度酒精脫水透明，中性樹膠封片；以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.2.3 B7-H4蛋白的表達分析 計數(shù)細胞膜和(或)細胞質(zhì)內(nèi)有黃色或棕黃色顆粒狀物的陽性染色細胞數(shù)，對B7-H4蛋白表達進行分析，染色強度根據(jù)陽性細胞百分比進行半定量分級：陽性細胞率=0為0級,<10%為1級，10%～50%為2級，50%～80%為3級，>80%為4級；結(jié)果判斷：陽性細胞百分比<10%為陰性，10%～100%為陽性。

1.3 統(tǒng)計學處理

應用SPSS16.0統(tǒng)計分析軟件采用χ2檢驗、Fisher確切概率法及Kruskua-Wallis Test，分析B7-H4蛋白的表達情況及卵巢漿液性癌B7-H4蛋白表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 B7-H4 mRNA表達

所有卵巢漿液性腫瘤中B7-H4 mRNA均有表達。

2.2 B7-H4蛋白在卵巢漿液性腫瘤細胞中的表達

B7-H4蛋白主要表達于卵巢漿液性腫瘤細胞細胞質(zhì)和(或)細胞膜，呈棕黃色。B7-H4蛋白在卵巢漿液性癌、交界性卵巢漿液性腫瘤和卵巢漿液性囊腺瘤組織中陽性表達率分別為75.0%(30/40)、50.0%(10/20)和13.3%(2/15)，陽性率逐級下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 B7-H4蛋白在卵巢漿液性腫瘤中的表達

注：*為漿液性癌組與交界性漿液性腫瘤組比較；**為交界性漿液性腫瘤組與漿液性囊腺瘤組比較；***為漿液性癌組與漿液性囊腺瘤組比較

2.3 B7-H4蛋白與卵巢漿液性癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

卵巢漿液性癌組織中B7-H4蛋白表達與患者年齡、FIGO分期、病理分級、腹腔積液細胞學和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無相關(guān)性，見表2。

表2 B7-H4蛋白在卵巢漿液性癌組織中的表達及與其臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例，%)

3 討論

卵巢惡性腫瘤是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，約占20%，且逐年呈上升趨勢，其中20%卵巢惡性腫瘤為惡性上皮性卵巢腫瘤。由于卵巢組織的解剖位置關(guān)系，早期癥狀不明顯且缺乏有效的檢測手段，大多數(shù)患者就診時已為中晚期，預后差、5年存活率較低,其中以卵巢漿液性癌居多。早期發(fā)現(xiàn)與早期診斷是改善卵巢癌患者預后的有效措施之一，因此，尋找到1個早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、特異性強、靈敏度高的腫瘤分子標記物對于改善卵巢癌患者的預后具有重要的臨床和現(xiàn)實意義，同時也能為新型靶向治療技術(shù)提供新的依據(jù)。

B7-H4分子又稱B7S1和B7x，是B7家庭中新近發(fā)現(xiàn)的1個成員，2003年Sina等[1]發(fā)現(xiàn)B7-H4蛋白屬于免疫球蛋白超家庭，人B7-H4序列含282個氨基酸，包括信號肽區(qū)、一對免疫球蛋白(IgV和IgC)胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)，屬I型跨膜蛋白。大量研究發(fā)現(xiàn)B7-H4在T細胞介導的免疫抑制中具有重要作用，它能抑制T細胞活化、增殖和細胞因子IL-1、IL-2等分泌，阻斷細胞周期使細胞停滯于G0/G1期、抑制CD8+CTL的增殖和成熟；在酵母細胞上構(gòu)建的真核質(zhì)粒胞漿表達鼠B7-H4能抑制T淋巴細胞增殖和IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ分泌；此外B7-H4在自身免疫性疾病過程中也發(fā)揮著重要作用，能下調(diào)器官自身特異性抗原反應，使實驗性腦脊髓炎加劇[1,9～12]。

本研究通過RT-PCR方法，檢測發(fā)現(xiàn)B7-H4 mRNA在卵巢漿液性腫瘤組織中均有表達，免疫組化法發(fā)現(xiàn)B7-H4蛋白在卵巢漿液性腫瘤細胞中呈細胞質(zhì)和(或)細胞膜表達，在卵巢漿液性癌、交界性卵巢漿液性腫瘤和卵巢漿液性囊腺瘤陽性表達率分別為75.0%(30/40)、50.0%(10/20)和13.3%(2/15)，陽性率呈逐級下降，差異均有統(tǒng)計學意義。Zhang等[3]在卵巢癌的研究發(fā)現(xiàn)，與交界性和良性卵巢腫瘤相比B7-H4顯著高表達在卵巢癌，B7-H4在漿液性卵巢癌的表達明顯高于黏液性卵巢癌，提示B7-H4蛋白表達增強可能導致腫瘤免疫逃逸從而促進卵巢癌的發(fā)生。Kryczek等[13]發(fā)現(xiàn)，惡性卵巢腫瘤中表達在巨噬細胞的B7-H4濃度與Treg數(shù)量顯著相關(guān)，Treg和腫瘤相關(guān)巨噬細胞上的B7-H4患者的愈后呈負相關(guān)。Salceda 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，B7-H4 分子的過度表達可以促進上皮細胞的惡性轉(zhuǎn)化，促使 SCID(重癥聯(lián)合免疫缺陷)鼠卵巢癌的形成，并保護上皮細胞免于失巢凋亡。Cheng等[15]發(fā)現(xiàn)B7-H4能直接促進卵巢癌SKOV3細胞生長和惡化。其他腫瘤中B7-H4蛋白表達的研究發(fā)現(xiàn)均提示它在腫瘤免疫逃逸和不良預后中起著重要作用；Hyunkeun等[16]發(fā)現(xiàn)B7-H4表達的B細胞易感染EB病毒，B7-H4靶向治療可誘導感染EB病毒的B細胞凋亡。

雖然B7-H4 在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用和機制尚未完全明確，但它與卵巢漿液性癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，作為卵巢漿液性癌患者治療的潛在靶位已逐步受到關(guān)注。B7-H4 在卵巢漿液性癌彌漫性高表達的特征為卵巢漿液性癌診斷和靶向治療提供了新的策略。

[1] Sica GL,Choi IH,Zhu G,et al.B7-H4,a molecule of the B7 family,negatively regulates T cell immunity〔J〕.Immunity,2003,18(6):849.

[2] Choi IH,Zhu G,Sica GL,et al.Genomic organization and expression analysis of B7-H4,an immune inhibitory molecule of the B7 family〔J〕.J Immunol,2003,171(9):4650.

[3] Zhang LL,Shao SL,Wu Y.Expressions of osteopontin and B7-H4 in epithelial ovarian neoplasm and their significance〔J〕.Ai zheng,2010,29(1):24.

[4] Yee EU,Zaino RJ,Torkko KC,et al.B7-H4 expression in Brenner tumours,a descriptive and comparative study〔J〕.Histopathology,2010,56(5):652.

[5] Zhang J,Zhang M,Jiang W,et al.B7-H4 gene polymorphisms are associated with sporadic breast cancer in a Chinese Han population 〔J〕.BMC Cancer,2009,11(9):394.

[6] 蔣 敏,顧國浩,張光波,等.可溶性B7-H4在食管癌患者血清中的表達分析〔J〕.廣東醫(yī)學，2009,30(6):925.

[7] Simon I,Liu Y,Krall KL,et al.Evaluation of the novel serum markers B7-H4,Spondin 2,and DcR3 for diagnosis and early detection of ovarian cancer〔J〕.Gynecol Oncol,2007,106(1):112.

[8] 魏雙燕，姜 潔，南芳芳,等.卵巢漿液性癌 B7-H4的表達及臨床病理意義〔J〕.現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展,2008,17(7):493.

[9] Zang X,Loke P,Kim J,et al.B7x:A widely expressed B7 family member that inhibits T cell activation〔J〕.PNAS,2003,100(18):10388.

[10] Prasad DVR,Richards S,Mai XM,et al.B7S1,a Novel B7 Family Member that Negatively Regulates T Cell Activation〔J〕.Immunity,2003,18(6):6863.

[11] Mao YX,Chen YJ,Ge Y,et al.Recombinant human B7-H4 expressed in Escherichia coli inhibits T lymphocyte proliferation and IL-2 secretion in vitro〔J〕.Acta Pharmacol Sin,2006,27(6):741.

[12] Qian Y,Yao HP,Cheng LF,et al.Expression and identification of recombinant mouse gene B7-H4〔J〕.Zhejiang Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban,2009,38(2):117.

[13] Kryczek I,Wei S,Zhu G,et al.Relationship between B7-H4,regulatory T cells,and patient outcome in human ovarian carcinoma〔J〕.Cancer Res,2007,67(18):8900.

[14] Salceda S,Tang T,Kmet M,et al.The immunomodulatory protein B7-H4 is overexpressed in breast and ovarian cancers and promotes epithelial cell transformation〔J〕.Exp Cell Res,2005,306(1):128.

[15] Cheng L,Jiang J,Gao R,et al.B7-H4 expression promotes tumorigenesis in ovarian cancer〔J〕.Int J Gynecol Cancer,2009,19(9):1481.

[16] Song H,Park G,Kim YS,et al.B7-H4 reverse signaling induces the apoptosis of EBV-transformed B cells through Fas ligand up-regulation〔J〕.Cancer Letters，2008,266:227.