李 華 陳于平 楊捷生 楊衛(wèi)平 劉迪填

食管癌是我國常見惡性腫瘤之一，但確診時多已是中晚期，故治愈率較低，預(yù)后差。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是其重要的轉(zhuǎn)移途徑之一，但機(jī)制尚未完全清楚。VEGF-C是1種腫瘤細(xì)胞分泌的淋巴管生成因子，與多種腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究通過檢測VEGF-C在食管鱗癌中的表達(dá)，以探討其與食管癌臨床病理特征的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院2007年6月至2009年9月手術(shù)切除的食管鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本，共173份。男性131例，女性42例。年齡39～76歲，平均年齡56.9歲，中位年齡57歲。所有患者術(shù)前均未接受過放療或化療。按照美國癌癥研究聯(lián)合會(AJCC)2002年制定的食管癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行術(shù)后病理學(xué)分期。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

采用Envision Labelled Peroxidase System (ELPS) 二步法，檢測食管鱗癌組織中VEGF-C蛋白的表達(dá)情況。

1.3 主要抗體和試劑

一抗兔抗人VEGF-C購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，原液來自美國ZYMED Laboratories Inc分裝產(chǎn)品。標(biāo)記二抗及DAB試劑盒購自上海長島生物有限公司。

1.4 免疫組化步驟

所有標(biāo)本經(jīng)常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚度連續(xù)切片。常規(guī)脫臘置水。蒸餾水洗3次，每次 3min。3%過氧化氫封閉10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶。采用pH=6.0的0.01 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液微波修復(fù)抗原15 min。兔抗人VEGF-C (工作濃度為1∶70)4℃濕盒過夜。PBS洗3次，每次5 min。加酶標(biāo)通用型二抗，37℃孵育30 min。PBS洗3次，每次5 min。DAB顯色。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。以結(jié)腸腺癌組織作為陽性對照，用PBS和正常兔血清代替一抗作為陰性對照。

1.5 結(jié)果判定方法

在400倍光鏡下隨機(jī)選取5 個視野，按照下述方法評分,取平均值。細(xì)胞質(zhì)無著色為0 分,呈淡黃染色為1 分,呈棕黃色為2 分,呈棕褐色或胞質(zhì)內(nèi)有棕黑色顆粒為3 分。陽性細(xì)胞數(shù)< 5 %為0 分,5 %～25 %為1 分,26 %～49 %為2 分,50 %～74 %為3 分,≥75 %為4 分。兩者相加之和為實(shí)驗(yàn)結(jié)果。陽性細(xì)胞數(shù)<5 %為陰性(-)；陽性細(xì)胞數(shù)>5 %、胞質(zhì)呈淡黃色及總分< 3 分為弱陽性(+)，總分3～5 分為陽性(++),總分≥5 分為強(qiáng)陽性(+++)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。采用χ2檢驗(yàn)分析VEGF-C與食管癌臨床病理特征的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 食管癌組織中VEGF-C表達(dá)情況

VEGF-C在食管癌組織中表達(dá)于胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒狀，呈灶性或彌漫性分布，多出現(xiàn)在癌巢的邊緣部位。173例食管癌組織中，VEGF-C表達(dá)陽性者144例(83.2%)，其中VEGF-C(+++)32例(18.5%)，VEGF-C(++)48例(27.8%)，VEGF-C(+)64例(37.0%)。

2.2 VEGF-C表達(dá)與食管癌臨床病理特征的關(guān)系(表1)

3 討論

腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移是受多因素調(diào)控的多步驟的復(fù)雜過程，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的主要途徑之一。研究食管癌淋巴轉(zhuǎn)移的機(jī)制、早期檢測和控制已成為食管癌防治的1個重要環(huán)節(jié)。長期以來，由于缺乏淋巴管特異性標(biāo)志物，人們對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的研究一直滯后于血道轉(zhuǎn)移的研究。1996年Joukov等[1]首次從人類前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3的cDNA文庫中克隆并分離出血管內(nèi)皮生長因子C(VEGF-C)。人VEGF-C基因位于4q34上，編碼產(chǎn)物為419個氨基酸殘基的蛋白，分子量為46.9 κD。VEGF-C屬于生長因子中的血管內(nèi)皮生長因子/血小板衍生生長因子(VEGF/PDGF)家族，也是VEGF家族中第1個被發(fā)現(xiàn)可促進(jìn)淋巴管生長的因子，它可通過自分泌或旁分泌的形式，與受體結(jié)合，具有調(diào)節(jié)血管生成、淋巴管生成和脈管通透性等作用。VEGF-C受體有VEGFR-2和VEGFR-3兩類。在成人期，VEGF-C與VEGFR-2結(jié)合促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的能力已明顯減弱，而VEGFR-3在胚胎早期血管中有廣泛的表達(dá)，但在胚胎發(fā)育后期和出生后則僅限于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞中有表達(dá)[2]。因此,在成人期,VEGF-C只特異性地與表達(dá)于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞中的VEGFR-3結(jié)合,激活VEGFR-3膜內(nèi)區(qū)的酪氨酸激酶，使得受體發(fā)生自身磷酸化,活化細(xì)胞骨架蛋白paxillin，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移；同時還可激活Ras/MAPK信號傳導(dǎo)通路或c-jun氨基末端激酶通路，誘導(dǎo)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞肌動蛋白重組，刺激其增殖、遷徙，并形成淋巴竇。從而促進(jìn)淋巴管的新生或擴(kuò)張，并可降低淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞間的黏附，提高淋巴管的通透性。增生的淋巴管增加了與腫瘤細(xì)胞接觸的面積，從而促進(jìn)了腫瘤的轉(zhuǎn)移。

表1 VEGF-C表達(dá)與食管癌臨床病理因素的關(guān)系(例)

食管癌的首選治療方法是手術(shù)治療，但其5年生存率僅為20%～30 %，轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是治療失敗的主要原因。如能抑制VEGF-C的表達(dá)或應(yīng)用VEGFR-3的中和抗體、可溶性細(xì)胞外片段或低分子量抑制物抑制VEGF-C/VEGFR-3信號傳導(dǎo)通路，則有可能抑制食管癌淋巴管的生成，進(jìn)一步抑制食管癌發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。已有研究表明，阻斷VEGF-C和VEGFR-3的結(jié)合可抑制VEGF-C促進(jìn)腫瘤細(xì)胞通過淋巴管轉(zhuǎn)移的作用[3]。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)，對173例食管鱗癌的VEGF-C蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)VEGF-C表達(dá)率高達(dá)83.24%，提示VEGF-C在食管鱗癌組織中高表達(dá)。本研究還發(fā)現(xiàn)早期食管癌組織和進(jìn)展期食管癌組織中VEGF-C的表達(dá)強(qiáng)度有顯著性差異，提示VEGF-C表達(dá)強(qiáng)度可能隨著食管癌的發(fā)生和進(jìn)展而逐漸增強(qiáng)。已有研究表明VEGF-C表達(dá)在正常食管黏膜經(jīng)Barrett食管到腺癌的過程中有逐漸增強(qiáng)的趨勢[4]。

本研究還發(fā)現(xiàn)，VEGF-C表達(dá)與患者年齡、性別、血型、家族史、腫瘤部位、腫瘤長度、病理分型、浸潤深度及病理學(xué)分級無相關(guān)性，而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及病理分期有關(guān)。提示VEGF-C蛋白的表達(dá)與食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及其淋巴結(jié)受累程度密切相關(guān)。這與在甲狀腺癌、前列腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、肺癌的研究結(jié)果相似，這些研究都發(fā)現(xiàn)了VEGF-C的表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移高度相關(guān)[5]。由于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是預(yù)測食管癌預(yù)后的1個明確指標(biāo)，所以VEGF-C將來有可能作為間接預(yù)測食管癌預(yù)后的1個指標(biāo)。

總之，VEGF-C在食管癌中高表達(dá)，并通過誘導(dǎo)食管癌淋巴管的生成來促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。因此，檢測食管癌中VEGF-C的表達(dá)可作為判斷是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的1個重要的生物學(xué)指標(biāo)。VEGF-C有可能成為食管癌臨床治療的1個新的靶點(diǎn)。

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